Alsgeýmer keselinde (AD) diagnozyň we bejerginiň gidişine päsgel berýän köp sanly patofiziologiýany görkezýän belok biomarkerleri ýetmezçilik edýär. Bu ýerde, AD patofiziologiýasynyň giň gerimini görkezýän serebrospinal suwuklygy (CSF) biomarkerleri kesgitlemek üçin giňişleýin proteomikleri ulanýarys. Multiplex köpçülik spektrometri degişlilikde AD CSF we beýnide takmynan 3500 we takmynan 12,000 belok kesgitledi. Beýni proteomynyň tor seljermesi 44 biodürlüligiň modulyny çözdi, olaryň 15-si serebrospinal suwuklyk proteomy bilen gabat gelýär. Bu birmeňzeş modullardaky CSF AD markerleri dürli patofiziologiki amallary görkezýän bäş sany belok toparyna bölünýär. AD beýnisindäki sinapslar we metabolitler azalýar, ýöne CSF köpelýär, beýnide we CSF-de glial baý miýelinasiýa we immun toparlary köpelýär. Panel üýtgemeleriniň yzygiderliligi we kesel aýratynlygy 500-den gowrak goşmaça CSF nusgalarynda tassyklandy. Bu toparlar asimptomatiki AD-da biologiki kiçi toparlary hem kesgitlediler. Umuman aýdanyňda, bu netijeler AD-da kliniki amaly programmalar üçin web esasly biomarker gurallary üçin geljegi uly ädimdir.
Alsgeýmer keseli (AD) dünýäde newrodegeneratiw demansyň iň köp ýaýran sebäbi bolup, sinaptiki geçiş, glial-ara immunitet we mitohondrial metabolizm (1-3) ýaly köp biologiki ulgamyň işlemezligi bilen häsiýetlendirilýär. Şeýle-de bolsa, döredilen belok biomarkerleri henizem amiloid we tau belogyny tapmaga ünsi jemleýär we şonuň üçin bu dürli patofiziologiýany görkezip bilmeýär. Serebrospinal suwuklykda (CSF) iň ygtybarly ölçenýän bu “ýadro” belok biomarkerlerine (i) kortikal amiloid plakatlaryň emele gelmegini görkezýän amiloid beta peptid 1-42 (Aβ1-42) degişlidir; (ii) jemi tau, aksonyň zaýalanmagynyň alamaty; (iii) fosfor-tau (p-tau), patologiki tau giperfosforilýasiýasynyň wekili (4-7). Bu serebrospinal suwuklyk biomarkerleri “bellenen” AD belok kesellerini (4-7) ýüze çykarmagymyza ep-esli kömek eden hem bolsa, bu keseliň aňyrsyndaky çylşyrymly biologiýanyň az bölegini görkezýär.
AD biomarkerleriniň patofiziologiki dürlüliginiň ýoklugy köp kynçylyklara sebäp boldy, şol sanda (i) AD hassalarynyň biologiki birmeňzeşligini kesgitläp we kesgitläp bilmezlik, (ii) keseliň agyrlygyny we ösüşini ýeterlik ölçemezlik, esasanam kliniki döwürde we ( iii) newrologiki ýaramazlygyň ähli taraplaryny doly çözüp bilmedik bejeriş dermanlarynyň ösüşi. AD-ny baglanyşykly kesellerden beýan etmek üçin ähmiýetli patologiýa bil baglamagymyz bu problemalary hasam kynlaşdyrýar. Demansly garry adamlaryň köpüsiniň aň-düşünjäniň peselmeginiň birden köp patologiki häsiýetiniň bardygyny görkezýän subutnamalar (8). AD patologiýasy bolan adamlaryň 90% ýa-da ondan köpüsinde damar keseli, TDP-43 goşulmalary ýa-da beýleki degeneratiw keseller bar (9). Patologiki gabat gelişiň bu ýokary mukdary demans üçin häzirki anyklaýyş binýadymyzy bozdy we keseliň has giňişleýin patofiziologiki kesgitlemesi zerurdyr.
Dürli AD biomarkerleriniň gyssagly zerurlygyny göz öňünde tutup, meýdan biomarkerleri tapmak üçin umumy ulgamyň esasynda “omics” usulyny has köp ulanýar. Çaltlandyrylan farmasewtiki hyzmatdaşlyk (AMP) -AD bileleşigi 2014-nji ýylda döredilip, maksatnamanyň başynda durýar. Milli saglyk institutlarynyň, akademiýalaryň we senagatyň bu köp ugurly tagallasy, AD patofiziologiýasyny has gowy kesgitlemek we biodürlüligi anyklaýyş derňewi we bejeriş strategiýalaryny ösdürmek üçin ulgamlaýyn strategiýalary ulanmagy maksat edinýär (10). Bu taslamanyň bir bölegi hökmünde, tor proteomikasy AD-da ulgam esasly biomarkerleri ösdürmek üçin geljegi uly gural boldy. Maglumatlara esaslanýan bu bitewi çemeleşme, belli bir öýjük görnüşleri, organeller we biologiki funksiýalar bilen baglanyşykly birleşdirilen beloklaryň toparlara ýa-da “modullaryna” çylşyrymly proteomika maglumatlary gurnaýar (11-13). AD beýnisinde 12-e golaý maglumat baý proteomika gözlegleri geçirildi (13-23). Umuman aýdanyňda, bu seljermeler AD beýni ulgamynyň proteomynyň garaşsyz koortlarda we köp kortikal sebitlerde ýokary derejede goralýan modul guramasyny saklaýandygyny görkezýär. Mundan başga-da, bu modullaryň käbiri, köp keselleriň patofiziologiýasyny görkezýän maglumatlar toplumynda AD bilen baglanyşykly bolçulykda köpelýän üýtgeşmeleri görkezýär. Köpçülikleýin geçirilen bu netijeler, beýni ulgamynyň proteomyny AD-da ulgam esasly biomarker hökmünde tapmak üçin geljegi uly labyr nokadyny görkezýär.
AD beýni ulgamynyň proteomyny kliniki taýdan peýdaly ulgam esasly biomarkerlere öwürmek üçin beýniden alnan ulgamy AD CSF-iň proteomiki derňewi bilen birleşdirdik. Bu toplumlaýyn çemeleşme, sinapslar, gan damarlary, miýelinasiýa, çişme we metabolik ýollaryň işlemezligi ýaly beýniniň esasly patofiziologiýasy bilen baglanyşykly CSF biomarkerleriniň bäş sany geljegi uly toplumynyň kesgitlenmegine sebäp boldy. Dürli newrodegeneratiw kesellerden 500-den gowrak CSF nusgasyny goşmak bilen, köpeltmek derňewleriniň üsti bilen bu biomarker panellerini üstünlikli tassykladyk. Bu tassyklama derňewleri, asimptomatiki AD (AsymAD) näsaglaryň CSF-de toparlaýyn maksatlary barlamagy ýa-da adaty bilim gurşawynda amiloidiň adaty bolmadyk ýygnanmagynyň subutnamasyny görkezmegi öz içine alýar. Bu seljermeler AsymAD ilatynyň biologiki birmeňzeşligini görkezýär we keseliň has irki döwürlerinde şahsyýetleri ýazyp bilýän panel belliklerini kesgitleýär. Umuman aýdanyňda, bu netijeler AD-yň ýüzbe-ýüz bolýan kliniki kynçylyklarynyň köpüsini üstünlikli çözüp bilýän birnäçe ulgamlara esaslanýan belok biomarker gurallaryny ösdürmekde möhüm ädimdir.
Bu gözlegiň esasy maksady, AD-a eltýän dürli beýni esasly patofiziologiýany görkezýän täze serebrospinal suwuklyk biomarkerlerini kesgitlemekdir. S1-nji suratda gözleg usulyýetimiz görkezilýär, bu (i) AD CSF-iň deslapky tapyndylary we beýni bilen baglanyşykly CSF keseliniň biomarkerlerini kesgitlemek üçin tor beýni proteomy we (ii) soňraky köpeltmek Bu biomarkerler birnäçe garaşsyz serebrospinalda suwuk kohortlar. Tapyndylara gönükdirilen gözleg, akyl taýdan adaty 20 adamda we Emory Goizueta Alzheimer kesel gözleg merkezinde (ADRC) 20 AD hassasynda CSF-iň diferensial aňladylyşyny seljermek bilen başlandy. AD diagnozy, serebrospinal suwuklykda pes Aβ1-42 we ýokary derejeli tau we p-tau bar bolan aň-düşünjäniň bozulmagy hökmünde kesgitlenýär [Orta Monreal Biliş Bahalandyrmasy (MoCA), 13,8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (S1A tablisa). Dolandyryş (ortaça MoCA, 26,7 ± 2.2) CSF biomarkerleriniň kadaly derejesine eýe boldy.
Adam CSF, köp mukdarda belok bollygy bilen häsiýetlendirilýär, onda albumin we beýleki aşa köp beloklar gyzyklanma beloklarynyň tapylmagynyň öňüni alyp biler (24). Belok tapmagyň çuňlugyny ýokarlandyrmak üçin, köpçülikleýin spektrometriýa (MS) derňewinden öň her CSF nusgasyndan ilkinji 14 sany gaty köp belogy aýyrdyk. 40 nusgada 3691 proteoma düzülen MS tarapyndan jemi 39805 peptid kesgitlenildi. Beloklaryň mukdary köp tandem köpçülik belligi (TMT) belligi bilen ýerine ýetirilýär (18, 25). Missingitirilen maglumatlary çözmek üçin, indiki derňewde nusgalaryň azyndan 50% -inde kesgitlenen beloklary goşduk, netijede 2875 sany proteini kesgitledik. Beloklaryň umumy mukdaryndaky düýpli tapawut sebäpli gözegçilik nusgasy statistiki taýdan daşarky hasaplandy (13) we indiki seljerme goşulmady. Galan 39 nusganyň bolçulyk bahalary ýaşyna, jynsyna we partiýa bileleşigine görä düzüldi (13-15, 17, 18, 20, 26).
Regressiýa maglumatlar toplumynda diferensial aňlatmany bahalandyrmak üçin statistiki t-synag derňewini ulanyp, bu seljerme gözegçilik we AD ýagdaýlarynyň arasynda (P <0.05) ep-esli üýtgän beloklary kesgitledi (S2A Tablisa). 1A suratda görkezilişi ýaly, AD-da jemi 225 belokyň bollygy ep-esli azaldy we 303 belokyň bollygy ep-esli ýokarlandy. Differensial beýan edilen beloklara mikrotubula bagly belok tau (MAPT; P = 3.52 × 10−8), neýrofilament (NEFL; P = 6.56 × 10−3), ösüş bilen baglanyşykly belok 43 ýaly öň kesgitlenen serebrospinal suwuklyk AD markerleri bar. . P = 3.43 × 10−4) we VGF nerw ösüş faktory (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). Şeýle-de bolsa, jemi içerki önümiň bölüniş inhibitory 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) we SPARC bilen baglanyşykly modul kalsiý 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9) ýaly beýleki möhüm maksatlary kesgitledik. Gen Ontologiýasy (GO) 225 belokyň seljermesi, steroid alyş-çalşy, gan ýygnanmagy we gormon işjeňligi ýaly beden suwuklygy prosesleri bilen ýakyn arabaglanyşygy ýüze çykardy (1B surat we S2B tablisa). Munuň tersine, 303-den ep-esli ýokarlanan belok öýjük gurluşy we energiýa çalşygy bilen ýakyndan baglanyşyklydyr.
(A) Wulkan sýu ploteti, gözegçilik (CT) we Fhli beloklardan CSF proteomynyň AD ýagdaýlary. AD-da ep-esli peselýän beloklar (P <0.05) gök reňkde, keseliň derejesi ep-esli ýokarlanan beloklar gyzyl reňkde görkezilýär. Saýlanan belok bellik edilýär. (B) Belok bilen baglanyşykly iň ýokary GO terminleri AD-da ep-esli azalýar (gök) we köpelýär (gyzyl). Biologiki amallar, molekulýar funksiýalar we öýjükli komponentler boýunça iň ýokary z-ballary bolan üç sany GO termini görkezýär. (C) MS CSF nusgasynda (çepde) MAPT derejesini we ELISA tau derejesi (sagda) bilen arabaglanyşygyny ölçedi. Degişli P bahasy bilen Pearson korrelýasiýa koeffisiýenti görkezilýär. Bir AD hadysasy üçin ELISA maglumatlarynyň ýoklugy sebäpli bu sanlar seljerilen 39 hadysanyň 38-sine baha berýär. (D) Gözegçilikde geçirilen klaster derňewi (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) dolandyryşda P <0.01) sazlandy we AD CSF maglumatlar toplumynda iň üýtgän 65 belokdan peýdalanyp, nusgalary tapdy. Standartlaşdyryň, kadalaşdyryň.
MAPT-nyň proteomiki derejesi, MS ölçegimiziň dogrulygyny goldaýan garaşsyz ölçenen ELISA tau derejesi (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; 1C surat) bilen berk baglanyşyklydyr. Amiloid prekursor belogynyň (APP) derejesinde tripsin siňdirilenden soň, Aβ1-40 we Aβ1-42 C terminalyna düzülen izoform häsiýetli peptidler täsirli ionlaşdyrylyp bilinmez (27, 28). Şonuň üçin kesgitlän APP peptidlerimiziň ELISA Aβ1-42 derejeleri bilen hiç hili baglanyşygy ýok. Her hadysanyň diferensial aňlatmasyna baha bermek üçin, nusgalaryň gözegçilik edilýän klaster derňewini geçirmek üçin P <0.0001 [ýalan açyş tizligi (FDR) düzedilen P <0.01] bilen diferensial beýan edilen beloklary ulandyk (S2A Tablisa). 1D-nji suratda görkezilişi ýaly, bu 65 sany möhüm belok, gözegçilik meňzeş aýratynlyklary bolan bir AD hadysasyndan başga kesel ýagdaýyna görä nusgalary dogry toparlap biler. Bu 65 belokdan 63-si AD-da köpeldi, diňe ikisi (CD74 we ISLR) azaldy. Umuman alanyňda, bu serebrospinal suwuklyk derňewleri AD-da keseliň biomarkasy bolup hyzmat edip biljek ýüzlerçe belogy kesgitledi.
Soňra AD beýni proteomynyň garaşsyz tor derňewini etdik. Bu açyşyň beýni toparyna gözegçilikden (n = 10) dorsolaterial prefrontal korteks (DLPFC), Parkinson keseli (PD; n = 10), garyşyk AD / PD (n = 10) we AD (n = 10) degişlidir. ) Mysal. Emeri Goizueta ADRC. Bu 40 hadysanyň demografiýasy öň beýan edilipdi (25) we S1B tablisada jemlenendir. Bu 40 beýni dokumasyny we 27 hadysanyň köpeltmek toparyny seljermek üçin TMT-MS ulandyk. Umuman alanyňda, bu iki beýni maglumat toplumy 12 943 proteoma (25) düzülen 227,121 täsin peptid öndürdi. Soňky gözleglere diňe azyndan 50% -de kesgitlenen beloklar goşuldy. Iň soňky açyş maglumatlar toplumynda 8817 mukdarda belok bar. Belogyň bol derejesini ýaş, jyns we ölümden soňky aralyk (PMI) boýunça sazlaň. Regressiýadan soň goýlan maglumatlaryň diferensial aňlatma derňewi, iki ýa-da has köp kesel toparynda> 2000 belok derejesiniň ep-esli üýtgändigini görkezdi [P <0.05, üýtgemegiň derňewi (ANOVA)]. Soňra, diferensial beýan edilen beloklara esaslanan gözegçilik edilýän klaster derňewini etdik, AD / gözegçilik we / ýa-da AD / PD deňeşdirmelerinde P <0.0001 (S2, A we B surat, S2C tablisa). Bu 165 üýtgedilen belok, gözegçilik we PD nusgalaryndan AD patologiýasy bilen baglanyşykly hadysalary aç-açan suratlandyrýar, tutuş proteomda AD-a mahsus üýtgeşmeleri tassyklaýar.
Soňra ýüze çykarylan beýni proteomynda tor derňewini geçirmek üçin Agramly Gen Co-expression Network Analysis (WGCNA) atly algoritm ulandyk (11-13). Derňewde iň ulusyndan (M1, n = 1821 belok) iň kiçisine (M44, n = 34 belok) tertiplenen we sanlanan 44 modul (M) bilelikde görkezilen beloklar kesgitlenildi (2A surat we S2D tablisa). Aboveokarda belläp geçişimiz ýaly (13) Her modulyň wekilçilikli aňlatma profilini ýa-da häsiýetli belogyny hasaplaň we keseliň ýagdaýy we AD patologiýasy bilen baglanyşdyryň, ýagny Alsgeýmeriň keseller sanawy (CERAD) we Braak Score (2B surat) bilen birleşiň. Umuman alanyňda, 17 modul AD newropatologiýasy bilen ep-esli baglanyşyklydy (P <0.05). Kesel bilen baglanyşykly bu modullaryň köpüsi öýjük görnüşine mahsus markerlere-de baýdyr (2-nji surat). Aboveokarda aýdylyşy ýaly (13), öýjük görnüşini baýlaşdyrmak modulyň bir-birine gabat gelmegini we öýjük görnüşine mahsus genleriň salgylanma sanawyny seljermek arkaly kesgitlenýär. Bu genler, izolirlenen syçan neýronlarynda, endotel we glial öýjüklerinde çap edilen maglumatlardan alnan. RNK yzygiderliligi (RNA-seq) synag (29).
(A) Beýni proteomynyň WGCNA-ny tapyň. . Pozitiw (gyzyl) we otrisatel (gök) korrelýasiýalaryň intensiwligi iki reňkli ýylylyk kartasy bilen, ýyldyzjyklar bolsa statistik ähmiýeti görkezýär (P <0.05). Her belok modulynyň öýjük görnüş birleşmesine baha bermek üçin Gipergeometrik Balykçynyň takyk synagyny (FET) ulanyň. Gyzyl kölegäniň intensiwligi öýjük görnüşini baýlaşdyrmagyň derejesini, ýyldyzjyk bolsa statistik ähmiýeti görkezýär (P <0.05). FET-den alnan P bahasyny düzetmek üçin BH usulyny ulanyň. (C) Modully beloklaryň GO derňewi. Iň ýakyn baglanyşykly biologiki amallar her modul ýa-da baglanyşykly modul topary üçin görkezilýär. oligo, oligodendrosit.
Closelyakyn baglanyşykly astrosit we mikroglýa baý modullaryň toplumy (M30, M29, M18, M24 we M5) AD newropatologiýasy bilen güýçli oňyn arabaglanyşygy görkezdi (2B surat). Ontologiýa derňewi bu glial modullary öýjükleriň ösmegi, köpelmegi we immuniteti bilen baglanyşdyrýar (2C-nji surat we S2E tablisa). Iki goşmaça glial modul, M8 we M22 hem keselde berk düzgünleşdirilýär. M8, dogabitdi immunitetde möhüm rol oýnaýan signal beriji kaskad, Toll ýaly reseptor ýoly bilen ýokary baglanyşyklydyr (30). Şol bir wagtyň özünde, M22 terjimeden soňky üýtgeşme bilen ýakyndan baglanyşyklydyr. Oligodendrositlere baý M2, AD patologiýasy bilen güýçli oňyn arabaglanyşygy we nukleozid sintezi we DNK köpeltmesi bilen ontologiki baglanyşygy görkezýär, bu kesellerde öýjükleriň köpelmegini görkezýär. Umuman aýdanyňda, bu tapyndylar, AD tor proteomynda öň gören glial modullarymyzyň ýokarlanmagyny goldaýar (13, 17). Häzirki wagtda tordaky AD bilen baglanyşykly glial modullaryň köpüsiniň gözegçilikde we PD ýagdaýlarynda has pes aňlatma derejesini görkezýändigi, olaryň kesel aýratynlyklaryny AD-da ýokarlandyrýandygyny görkezýär (S2C surat).
Tor proteomymyzdaky diňe dört modul (M1, M3, M10 we M32) AD patologiýasy (P <0.05) bilen berk negatiw baglanyşykda (2-nji surat, B we C). M1 we M3 ikisi hem neýron markerlerine baý. M1 sinaptiki signallar bilen ýokary derejede baglanyşykly bolsa, M3 mitokondrial funksiýa bilen ýakyndan baglanyşyklydyr. M10 we M32 üçin öýjük görnüşini baýlaşdyrmagyň subutnamasy ýok. M32 M3 bilen öýjükleriň alyş-çalşynyň arasyndaky baglanyşygy görkezýär, M10 bolsa öýjükleriň ösmegi we mikrotubulalaryň işi bilen ýokary derejede baglanyşyklydyr. AD bilen deňeşdirilende, dört modulyň hemmesi gözegçilikde we PD-da ýokarlanýar we olara kesele mahsus AD üýtgeşmelerini berýär (S2C surat). Umuman aýdanyňda, bu netijeler öň AD-da gören neýronlara baý modullaryň azalmagyny goldaýar (13, 17). Gysgaça aýdanymyzda, beýnimiziň proteomynyň tor seljermesi, öňki tapyşlarymyza laýyk gelýän AD-da üýtgedilen modullary öndürdi.
AD irki asimptomatiki tapgyr (AsymAD) bilen häsiýetlendirilýär, onda şahsyýetler kliniki bilim peselmezden amiloid ýygnamagyny görkezýärler (5, 31). Bu asimptomatiki etap, ir ýüze çykarmak we gatyşmak üçin möhüm penjiräni görkezýär. Mundan ozal garaşsyz maglumatlar toplumynda AsymAD we AD beýni ulgamynyň proteomynyň güýçli modully saklanyşyny görkezdik (13, 17). Häzirki wagtda açan beýnimiz ulgamynyň bu öňki netijelere laýyk gelmegini üpjün etmek üçin 27 DLPFC guramasyndan göçürilen maglumatlarda 44 modulyň saklanmagyny seljerdik. Bu guramalara gözegçilik (n = 10), AsymAD (n = 8) we AD (n = 9) ýagdaýlary girýär. Dolandyryş we AD nusgalary açyş beýnimiz kohortynyň (S1B Tablisa) derňewine girizildi, AsymAD hadysalary diňe köpeltmek kohortynda üýtgeşikdi. Bu AsymAD hadysalary Emory Goizueta ADRC beýni bankyndan hem ýüze çykdy. Ölümde biliş kadaly bolsa-da, amiloid derejesi adatdan daşary ýokarydy (ortaça CERAD, 2,8 ± 0,5) (S1B tablisa).
Bu 27 beýni dokumasynyň TMT-MS derňewi 11,244 belok mukdaryny kesgitledi. Bu soňky san, nusgalaryň azyndan 50% -inde kesgitlenen beloklary öz içine alýar. Bu köpeldilen maglumatlar toplumy, açyş beýnimiziň derňewinde ýüze çykarylan 8817 belogyň 8638-sini (98.0%) öz içine alýar we gözegçilik we AD kohortlarynyň arasynda 3000-e golaý belok üýtgedi (Tukiniň deňeşdirme seljermesi üçin Tukiniň jübütlenen synagyndan soň) (P <0.05) Tablisa S2F). Differensial beýan edilen beloklaryň arasynda 910 AD we beýni proteome gözegçilik hadysalarynyň arasynda ep-esli derejede üýtgeşmeleri görkezdi (ANOVA Tukey jübütlenen synagdan soň P <0.05). Bu 910 markeriň proteomlaryň (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) arasyndaky üýtgeşme ugruna örän laýykdygyny bellemelidiris (S3A surat). Köpeldilen beloklaryň arasynda maglumatlar toplumynyň arasynda iň yzygiderli üýtgeşmeler bolan beloklar esasan gliýa baý M5 we M18 modullarynyň agzalarydyr (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 we GFAP). Azaldylýan beloklaryň arasynda iň yzygiderli üýtgeşmeler bolanlar, diňe sinaps bilen baglanyşykly M1 modulynyň (NPTX2, VGF we RPH3A) agzalarydy. Mundan başga-da, orta süýümli (MDK), CD44, bölünip çykan doňdurylan belok 1 (SFRP1) we VGF-ni günbatar partlamalary bilen tassykladyk (S3B surat). Moduly gorap saklamak derňewi, beýni proteomundaky belok modullarynyň (34/44) takmynan 80% köpeltmek maglumatlary toplumynda ep-esli derejede saklanandygyny görkezdi (z-score> 1.96, FDR P <0.05 düzedildi) (S3C surat). Bu modullaryň on dördüsi iki proteomyň arasynda ýörite saklandy (z-ball> 10, FDR düzedilen P <1.0 × 10−23). Umuman aýdanyňda, beýni proteomynyň arasyndaky diferensial aňlatmada we modully düzümde ýokary yzygiderliligiň tapylmagy we köpeldilmegi AD frontal korteks beloklarynyň üýtgemeleriniň köpelmegini görkezýär. Mundan başga-da, “AsymAD” we has ösen keselleriň beýni ulgamynyň gurluşyna gaty meňzeýändigini tassyklady.
Beýni köpeltmek maglumatlary toplumyndaky diferensial aňlatmanyň has jikme-jik seljermesi, AsimAD bilen dolandyryşyň arasynda (P <0.05) jemi 151 belok üýtgedilen AsymAD belogynyň üýtgemeginiň möhüm derejesini görkezýär (S3D surat). Amiloid ýük bilen yzygiderli, AsymAD we AD beýnisinde APP ep-esli ýokarlandy. MAPT diňe AD-da ep-esli üýtgeýär, bu bolsa tanglaryň derejesiniň ýokarlanmagyna we bilimiň peselmegi bilen belli korrelýasiýasyna laýyk gelýär (5, 7). Glial baý modullar (M5 we M18) AsymAD-da köpelýän beloklarda ýokary şöhlelendirilýär, neýron bilen baglanyşykly M1 moduly AsymAD-da azalýan beloklaryň iň wekili. Bu “AsymAD” markerleriniň köpüsi simptomatiki kesellerde has uly üýtgeşmeleri görkezýär. Bu bellikleriň arasynda beýni çişleri we gözleriň we el-aýaklaryň ösmegi bilen baglanyşykly M18-e degişli glial belok SMOC1 bar (32). MDK, öýjükleriň ösmegi we M18-iň başga bir agzasy bolan angiogenez (33) bilen baglanyşykly geparin baglanyşdyryjy ösüş faktorydyr. Dolandyryş topary bilen deňeşdirilende, AsymAD ep-esli ýokarlandy, soň AD-da has köpeldi. Munuň tersine, AsimAD beýnisinde sinaptiki belok neýropentraksin 2 (NPTX2) ep-esli azaldy. NPTX2 öň neýrojenerleşme bilen baglanyşyklydy we tolgundyryjy sinapslara araçylyk etmekde tanalýan roly bar (34). Umuman aýdanyňda, bu netijeler keseliň agyrlygy bilen öňe gidýän ýaly görünýän AD-da dürli dürli belok üýtgemelerini ýüze çykarýar.
Beýni proteomynyň tapylmagynda beloklaryň örtüginiň ep-esli çuňlugyna ýetendigimizi göz öňünde tutup, onuň tor derejesindäki AD transkriptomasy bilen bir-birine gabat gelşine has doly düşünmäge synanyşýarys. Şol sebäpden, AD (n = 308) we gözegçilik (n = 157) DLPFC dokumalaryna gözegçilik (13) 18,204 geniň mikroarraý ölçeginden ozal döreden modul bilen açan beýnimiz proteomyny deňeşdirdik. gabat gelmegi. Umuman alanyňda, 20 dürli RNK modulyny kesgitledik, olaryň köpüsi neýronlar, oligodendrositler, astrositler we mikroglýa ýaly belli öýjük görnüşleriniň baýlaşdyrylmagyny görkezdi (3A surat). AD-da bu modullaryň köp üýtgemegi 3B-nji suratda görkezilýär. Has çuňňur bellik edilmedik MS proteomyny (takmynan 3000 belok) (13) ulanyp, öňki belok-RNK üst-üstümizdäki derňewimize laýyk gelýän, beýnimizdäki proteome torundaky 44 modulyň köpüsi transkriptor ulgamynda ýerleşýär. beýnimiziň proteomynda ýokary derejede saklanýan 34 belok modulyny tapmagymyz we köpeltmegimiz, Fişeriň takyk synagyndan (FET) diňe 14 (~ 40%) geçdi, transkriptoma bilen statistik taýdan möhüm meňzeşligi subut etdi (3A surat). DNK zaýalanmagyny bejermek (P-M25 we P-M19), belok terjimesi (P-M7 we P-M20), RNK baglanyşdyryjy / bölmek (P-M16 we P-M21) we belogy nyşana almak (P-M13 we P-) bilen utgaşykly. M23) transkriptomadaky modullar bilen gabat gelmeýär. Şonuň üçin häzirki gabat gelýän derňewde (13) has çuňňur proteome maglumatlar toplumy ulanylsa-da, AD tor proteomlarynyň köpüsi transkriptor toruna düzülenok.
(A) Gipergeometrik FET, AD transkriptomasynyň (ýokarky) RNK modulynda öýjük görnüşine mahsus markerleriň baýlaşdyrylmagyny we AD beýnisiniň RNK (x-ok) bilen belok (y-ok) modullarynyň arasynda biri-birine meňzeşlik derejesini görkezýär. (aşaky). Gyzyl kölegäniň intensiwligi ýokarky paneldäki öýjük görnüşleriniň baýlaşdyryş derejesini we aşaky paneldäki modullaryň bir-birine gabat gelmegini görkezýär. Asteriskler statistik ähmiýeti görkezýär (P <0.05). (B) Her transkriptom modulynyň häsiýetli genleri bilen AD ýagdaýynyň arasyndaky baglanyşyk derejesi. Çep tarapdaky modullar AD (gök) bilen iň negatiw korrelýasiýa, sag tarapdakylar bolsa AD (gyzyl) bilen iň oňyn korrelýasiýa. Logurnalda üýtgedilen BH düzedilen P bahasy, her korrelýasiýanyň statistik ähmiýetini görkezýär. (C) Öýjük görnüşini umumylaşdyrmak bilen ep-esli gabat gelýän modullar. (D) Bir-biriniň üstünden düşýän modulda bellenen belogyň (x-ok) we RNK (y-ok) log2 esse üýtgemeginiň korrelýasiýa derňewi. Degişli P bahasy bilen Pearson korrelýasiýa koeffisiýenti görkezilýär. Mikro, mikroglýa; asman jisimleri, astrositler. KT, gözegçilik.
Bir-birine gabat gelýän belok we RNK modullary meňzeş öýjük görnüşini baýlaşdyryş profilini we yzygiderli AD üýtgetmek ugurlaryny paýlaşýarlar (3-nji surat, B we C). Başga sözler bilen aýdylanda, beýni proteomynyň sinaps bilen baglanyşykly M1 moduly (PM 1) üç sany neýronlara baý birmeňzeş RNK modulyna (R-M1, R-M9 we R-M16) kartalaşdyryldy, bularyň ikisi hem AD-da görkezildi derejesi peseldi. Şonuň ýaly-da, gliýa baý M5 we M18 belok modullary, astrositlere we mikroglial markerlere (R-M3, R-M7 we R-M10) baý RNK modullary bilen bir-birine gabat gelýär we keselleriň köpelmegine gatnaşýar. Iki maglumat toplumynyň arasyndaky bu umumy modul aýratynlyklary, öýjük görnüşini baýlaşdyrmagy we beýnimiziň proteomynda gören keseller bilen baglanyşykly üýtgeşmeleri hasam goldaýar. Şeýle-de bolsa, bu umumy modullarda RNK bilen aýratyn markerleriň belok derejeleriniň arasynda köp tapawutlary gördük. Bu birmeňzeş modullaryň içindäki molekulalaryň proteomikasynyň we transkriptomikasynyň diferensial aňladylyşynyň korrelýasiýa derňewi (3D surat) bu gapma-garşylygy görkezýär. Mysal üçin, APP we başga-da birnäçe glial modul beloklary (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 we SFRP1) AD proteomynyň ep-esli ýokarlanandygyny görkezdi, ýöne AD transkriptomasynda üýtgeşiklik ýokdy. Beloklara mahsus bolan bu üýtgeşmeler, proteomy patologiki üýtgemeleriň çeşmesi hökmünde görkezýän amiloid plakatlar (23, 35) bilen ýakyn baglanyşykly bolup biler we bu üýtgeşmeler transkriptomada şöhlelendirilip bilinmez.
Beýnimizi we CSF proteomlarymyzy özbaşdak seljerenimizden soň, beýni ulgamynyň patofiziologiýasy bilen baglanyşykly AD CSF biomarkerlerini kesgitlemek üçin iki maglumat toplumyny giňişleýin seljerdik. Ilki bilen iki proteomyň bir-birine meňzeşligini kesgitlemeli. CSF-iň AD beýnisinde (4) neýrohimiki üýtgemeleri görkezýändigi giňden kabul edilse-de, AD beýni bilen CSF proteomynyň arasyndaky takyklyk derejesi takyk däl. Iki proteomymyzda ýüze çykarylan umumy gen önümleriniň sanyny deňeşdirip, serebrospinal suwuklykda ýüze çykarylan beloklaryň takmynan 70% -iniň (n = 1936) beýnide hem kesgitlenendigini gördük (4A surat). Bu birmeňzeş beloklaryň köpüsi (n = 1721), beýni açyş maglumatlary toplumyndan 44 sany aňlatma modulynyň birine düzülendir (4B surat). Garaşylyşy ýaly, beýniniň alty sany uly moduly (M1-den M6) CSF-iň iň köp gabat gelşini görkezdi. Şeýle-de bolsa, beýniniň modulyndan iki esse uly, garaşylmadyk ýokary derejä ýetýän has kiçi beýni modullary bar (mysal üçin, M15 we M29). Bu, beýnimiz bilen serebrospinal suwuklygyň arasyndaky meňzeşligi hasaplamak üçin has jikme-jik, statistik usulda işlemäge itergi berýär.
(A we B) Tapyndy beýnisinde we CSF maglumatlarynda ýüze çykarylan beloklar biri-birine gabat gelýär. Bu biri-birine gabat gelýän beloklaryň köpüsi, beýni aňlatma ulgamynyň 44 sany aňlatma modulynyň biri bilen baglanyşykly. (C) Serebrospinal suwuklyk proteome bilen beýni ulgamynyň proteomynyň arasyndaky meňzeşligi tapyň. Heatylylyk kartasynyň her hatary gipergeometrik FET-iň aýratyn birmeňzeş derňewini görkezýär. Rowokarky hatarda beýniniň moduly bilen tutuş CSF proteomynyň arasyndaky gapma-garşylyk (çal / gara kölege) şekillendirilýär. Ikinji setir, beýni modullary bilen CSF belogynyň (gyzyl reňkde) arasyndaky gabat gelişiň AD-da ep-esli derejede kadalaşdyrylandygyny görkezýär (P <0.05). Üçünji hatar, beýni modullary bilen CSF belogynyň (gök öwüşginli) arasyndaky gabat gelişiň AD-da ep-esli derejede kadalaşýandygyny görkezýär (P <0.05). FET-den alnan P bahasyny düzetmek üçin BH usulyny ulanyň. (D) Öýjük görnüşli birleşme we degişli GO şertleri esasynda bukulýan modul paneli. Bu panellerde CSF proteomynda manyly diferensial aňlatma eýe bolan jemi 271 belok bar.
Bir guýrukly FET-leri ulanyp, CSF proteome bilen aýry-aýry beýni modullarynyň arasynda beloklaryň bir-birine gabat gelmeginiň ähmiýetine baha berdik. Derňew, CSF maglumatlar toplumyndaky jemi 14 beýni modulynyň statistik taýdan ähmiýetli gabat gelişleriniň (FDR düzedilen P <0.05) we biri-biriniň üstaşyr ähmiýetine ýakyn bolan goşmaça modulyň (F18 düzedilen P = 0.06) ýüze çykandygyny ýüze çykardy (4C surat) , ýokarky hatar). Şeýle hem, dürli görnüşli CSF beloklary bilen berk gabat gelýän modullar bilen gyzyklanýarys. Şonuň üçin (i) CSF belogynyň haýsysynyň AD-da ep-esli ýokarlanandygyny we (ii) CSF belogynyň AD-da ep-esli azalandygyny kesgitlemek üçin iki sany goşmaça FET derňewi etdik (P <0.05, jübütlenen test AD / gözegçilik) Beýni modullary manyly gabat gelýär arasynda. 4C-nji suratyň orta we aşaky hatarlarynda görkezilişi ýaly, bu goşmaça derňewler 44 beýni modulynyň 8-siniň AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, M38) bilen goşulan belok bilen ep-esli gabat gelýändigini görkezýär. . ), diňe iki modul (M6 we M15) AD CSF-de azalýan belok bilen manyly bir-birine meňzeýär. Garaşylyşy ýaly, 10 modulyň hemmesi CSF proteomy bilen iň ýokary gabat gelýän 15 modulda. Şonuň üçin bu 15 modulyň AD beýnisinden alnan CSF biomarkerleriniň ýokary öndürijilikli çeşmesidigini çaklaýarys.
WGCNA agaç diagrammasyndaky ýakynlygy we öýjük görnüşleri we gen ontologiýasy bilen baglanyşygy esasynda bu 15 sany birmeňzeş moduly bäş sany uly belok paneline böldük (4D-nji surat). Birinji panelde neýron markerlerine we sinaps bilen baglanyşykly beloklara (M1 we M12) baý modullar bar. Sinaptiki panelde jemi 94 belok bar we CSF proteomynyň derejesi ep-esli üýtgedi we bäş paneliň arasynda beýni bilen baglanyşykly CSF markerleriniň iň uly çeşmesine öwrüldi. Ikinji topar (M6 we M15) endotel öýjük bellikleri we damar bedeni bilen “ýarany bejermek” (M6) we “gülkünç immunitetiň kadalaşdyrylyşy” (M15) ýaly ýakyn arabaglanyşygy görkezdi. M15 endotel bilen ýakyndan baglanyşykly lipoprotein alyş-çalşy bilen hem baglanyşyklydyr (36). Damar panelinde beýni bilen baglanyşykly 34 CSF markeri bar. Üçünji topara oligodendrosit bellikleri we öýjükleriň köpelmegi bilen ep-esli baglanyşykly modullar (M2 we M4) girýär. Mysal üçin, M2-iň ýokary derejeli ontologiýa terminlerine “DNK köpeltmegiň oňyn kadalaşdyrylmagy” we “purin biosintezi prosesi” degişlidir. Bu aralykda, M4-de “glial öýjükleriň tapawudy” we “hromosoma bölünişi” bar. Miýelinasiýa panelinde beýni bilen baglanyşykly 49 CSF markeri bar.
Dördünji toparda iň köp modul (M30, M29, M18, M24 we M5) bar we ähli modullar diýen ýaly mikroglýa we astrosit belliklerine ep-esli baýdyr. Miýelinasiýa paneline meňzeş dördünji panelde öýjükleriň köpelmegi bilen ýakyndan baglanyşykly modullar (M30, M29 we M18) hem bar. Bu topardaky beýleki modullar, “immun täsir prosesi” (M5) we “immunitetiň täsirini kadalaşdyrmak” (M24) ýaly immunologiki adalgalar bilen ýokary baglanyşyklydyr. Glial immun topary beýni bilen baglanyşykly 42 CSF markerini öz içine alýar. Ahyrynda, soňky panelde dört modulda (M44, M3, M33 we M38) beýni bilen baglanyşykly 52 marker bar, bularyň hemmesi energiýa saklamak we metabolizm bilen baglanyşykly bedende. Bu modullaryň iň ulusy (M3) mitokondriýa bilen ýakyndan baglanyşyklydyr we neýronlara mahsus markerlere baýdyr. M38 bu metabolomadaky has kiçi modul agzalarynyň biridir we orta neýron aýratynlygyny görkezýär.
Umuman aýdanyňda, bu bäş panel AD korteksinde öýjük görnüşleriniň we funksiýalarynyň giň toplumyny görkezýär we bilelikde 271 beýni bilen baglanyşykly CSF markerini öz içine alýar (S2G Tablisa). Bu MS netijeleriniň dogrulygyna baha bermek üçin, köpeltmek mümkinçilikleri, ýokary duýgurlygy we aýratynlygy bolan ortogonal antikor esasly tehnologiýany ýakynlaşdyrma barlagyny (PEA) ulandyk we serebrospinal suwuklyk nusgalaryny täzeden analiz etdik, bu 271 biomarkeriň bir bölegini tapdyk. (n = 36). Bu 36 maksat, MS esasly tapyşlarymyz (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12) bilen ýakyndan baglanyşykly PEA-nyň AD köplügindäki üýtgeşmäni görkezýär, bu giňişleýin MS derňewimiziň netijelerini berk tassyklady (S4-nji surat) ).
Bäş toparymyzyň nygtaýan biologiki mowzuklary, sinaptiki signaldan başlap, energiýa çalşygyna çenli, bularyň hemmesi AD (1-3) patogenezi bilen baglanyşykly. Şonuň üçin bu panelleri öz içine alýan 15 modulyň hemmesi, açan beýnimiziň proteomundaky AD patologiýasy bilen baglanyşyklydyr (2-nji surat). Iň bellemeli zat, glial modullarymyzyň we iň uly neýron modullarymyzyň (M1 we M3) arasyndaky güýçli negatiw patologiki arabaglanyşykdyr. Göçürilen beýni proteomymyzyň diferensial aňlatma derňewi (S3D surat) M5 we M18-den alnan glial beloklary hem görkezýär. AsimAD we simptomatiki AD-da iň köp glial beloklar we M1 bilen baglanyşykly sinapslar Belok iň az azalýar. Bu gözegçilikler, bäş toparda kesgitlän 271 serebrospinal suwuklyk belgileriniň AD korteksindäki kesel prosesleri, şol sanda irki asimptomatiki döwürlerde ýüze çykýan hadysalar bilen baglanyşyklydygyny görkezýär.
Paneldäki beloklaryň beýnindäki we oňurga suwuklygyndaky üýtgeşme ugruny has gowy seljermek üçin, 15 sany biri-birine gabat gelýän modulyň her biri üçin aşakdakylary çyzdyk: (i) beýniniň maglumatlar toplumynda modulyň bollyk derejesini we (ii) moduly tapdyk belok Tapawut serebrospinal suwuklykda ýüze çykýar (S5-nji surat). Öň bellenip geçilişi ýaly, WGCNA moduldaky bollygy ýa-da beýnide häsiýetli belok bahasyny kesgitlemek üçin ulanylýar (13). Wulkan kartasy serebrospinal suwuklykda (AD / gözegçilik) modully beloklaryň diferensial aňladylyşyny beýan etmek üçin ulanylýar. Bu sanlar, bäş panelden üçüsiniň beýnide we oňurga suwuklygynda dürli aňlatma tendensiýalaryny görkezýändigini görkezýär. Synaps paneliniň iki moduly (M1 we M12) AD beýnisinde bollyk derejesiniň peselendigini görkezýär, ýöne AD CSF-de köpelýän belok bilen ep-esli gabat gelýär (S5A surat). Metabolomy (M3 we M38) öz içine alýan neýron bilen baglanyşykly modullar şuňa meňzeş beýni we serebrospinal suwuklygy aňlatmagyň nagyşlaryny görkezmeýär (S5E surat). Damar paneli dürli aňlatma tendensiýalaryny hem görkezdi, ýogsa-da modullary (M6 we M15) AD beýnisinde ortaça ýokarlandy we kesel CSF-de azaldy (S5B surat). Galan iki panelde beloklary iki bölümde yzygiderli kadalaşdyrylýan uly glial torlar bar (S5, C we D surat).
Bu tendensiýalaryň bu panellerdäki ähli bellikler üçin umumy däldigini ýadyňyzdan çykarmaň. Mysal üçin, sinaptiki panelde AD beýnisinde we CSF-de ep-esli azalýan birnäçe belok bar (S5A surat). Bu pes düzgünleşdirilen serebrospinal suwuklyk bellikleriniň arasynda NPTX2 we M1-iň VGF, M12-iň hromogranin B bar. Şeýle-de bolsa, bu kadadan çykmalara garamazdan, sinaptiki belliklerimiziň köpüsi AD oňurga suwuklygynda ýokarlanýar. Umuman aýdanyňda, bu derňewler bäş panelimiziň hersinde beýniniň we serebrospinal suwuklygyň derejesindäki statistik ähmiýetli tendensiýalary tapawutlandyrmagy başardy. Bu ugurlar, AD-da beýni bilen CSF belok görnüşiniň arasyndaky çylşyrymly we köplenç dürli gatnaşygy görkezýär.
Soň bolsa, 271 sany biomarker toplumymyzy iň geljegi uly we köpelip boljak maksatlara çenli çäklendirmek üçin ýokary geçişli MS köpeltmek derňewini (CSF köpeltmek 1) ulandyk (5A surat). CSF 1-nji göçürmede Emory Goizueta ADRC-den jemi 96 nusga bar, şol sanda gözegçilik, AsymAD we AD kohorty (S1A tablisa). Bu AD ýagdaýlary, aň-düşünjäniň peselmegi (ortaça MoCA, 20.0 ± 3.8) we serebrospinal suwuklykda tassyklanan AD biomarkerleriniň üýtgemegi bilen häsiýetlendirilýär (S1A tablisa). Tapylan CSF derňewimiziň tersine, bu köpeltmek has täsirli we ýokary öndürijilikli “bir okly” MS usuly bilen (çyzykly bölünişiksiz), aýratyn nusgalaryň immunodepletirlemeginiň zerurlygyny aradan aýyrýan ýönekeý nusga taýýarlyk protokolyny goşmak bilen ýerine ýetirilýär. . Muňa derek az mukdarda beloklaryň signalyny güýçlendirmek üçin immunitetiň azalýan “güýçlendiriji kanaly” ulanylýar (37). Proteomyň umumy örtügini azaldýan hem bolsa, bu bir gezeklik usul maşynyň wagtyny ep-esli gysgaldýar we analiz edip boljak TMT belgili nusgalaryň sanyny köpeldýär (17, 38). Umuman alanyňda, 96 hadysada 1,183 proteoma laýyk gelýän 6,487 peptid kesgitlenildi. CSF derňewinde bolşy ýaly, indiki hasaplamalara diňe nusgalaryň azyndan 50% -inde kesgitlenen beloklar girizildi we maglumatlar ýaşyň we jynsyň täsiri üçin regress edildi. Bu 792 proteomyň soňky mukdaryna sebäp boldy, olaryň 95% -i tapylan CSF maglumatlar toplumynda hem kesgitlenildi.
(A) Beýni bilen baglanyşykly CSF belok nyşanlary, ilkinji köpeldilen CSF kohortynda barlanyldy we soňky panelde (n = 60) bar. (B-den E) Dört sany CSF köpeltmek kohortynda ölçelýän panel biomarker derejesi (birleşdirilen z-ballar). Jübütlenen synaglar ýa-da Tukiniň düzedişinden soň ANOVA, her bir köpeltmek derňewinde bolçulygyň üýtgemeginiň statistik ähmiýetine baha bermek üçin ulanyldy. KT, gözegçilik.
Aýratyn hem giňişleýin seljerme arkaly 271 beýnimiz bilen baglanyşykly CSF maksatlarymyzy barlamak bilen gyzyklanýandygymyz sebäpli, bu köpeldilen proteomyň mundan beýläk gözden geçirilmegini bu bellikler bilen çäklendireris. Bu 271 belokyň arasynda CSF köpeltmek 1-de 100 tapyldy. S6A suratda gözegçilik we AD köpeltmek nusgalarynyň arasynda bu 100 gabat gelýän markeriň diferensial aňlatmasy görkezilýär. Sinaptiki we metabolit gistonlary AD-da iň köp ýokarlanýar, damar beloklary keselde iň köp azalýar. Gabat gelýän 100 markeriň köpüsi (n = 70) iki maglumat toplumynda üýtgemegiň şol bir ugruny saklady (S6B surat). Bu 70 tassyklanan beýni bilen baglanyşykly CSF markerleri (Tablisa S2H), öň syn edilen paneliň aňlatma tendensiýalaryny, ýagny damar beloklarynyň pes düzgünleşdirilmegini we beýleki panelleriň sazlanyşyny görkezýär. Bu 70 tassyklanan belokdan diňe 10-sy bu panel tendensiýalaryna ters gelýän AD bollygyndaky üýtgeşmeleri görkezdi. Beýniniň we serebrospinal suwuklygyň umumy tendensiýasyny iň gowy görkezýän bir panel döretmek üçin, bu 10 belogy ahyrsoňy barlan gyzyklanma panelimizden çykardyk (5A surat). Şol sebäpden, panelimizde dürli nusga taýýarlygy we MS platforma derňewi ulanyp, iki sany garaşsyz CSF AD kohortynda barlanan jemi 60 sany belok bar. CSF göçürme 1 gözegçilik we AD ýagdaýlaryndaky bu soňky panelleriň z-ball aňlatma ýerleri, tapylan CSF toparymyzda görlen panel tendensiýasyny tassyklady (5B surat).
Bu 60 belokyň arasynda AD bilen baglanyşykly belli bolan molekulalar bar, meselem, osteopontin (SPP1), köp barlaglarda (39-41) AD bilen baglanyşykly çişmä garşy sitokin we sinaptiki belok GAP43 bar. newrodegenerasiýa bilen anyk baglanyşyklydyr (42). Iň doly barlanan beloklar, amyotrofik gapdal skleroz (ALS) bilen baglanyşykly superoksid dismutaz 1 (SOD1) we Parkinson keseli bilen baglanyşykly desakaraza (PARK7) ýaly beýleki newrodegeneratiw keseller bilen baglanyşykly belliklerdir. Şeýle hem, SMOC1 we beýnine baý membrana birikdiriji signal beriji belok 1 (BASP1) ýaly köp sanly markerleriň newrodegenerasiýa bilen öňki baglanyşyklarynyň çäklidigini tassykladyk. CSF proteomynda umumy bollygy sebäpli, MAPT we beýleki AD bilen baglanyşykly beloklary (mysal üçin, NEFL we NRGN) ygtybarly kesgitlemek üçin bu ýokary geçişli bir gezeklik kesgitlemek usulyny ulanmagymyzyň kyndygyny bellemelidiris. ) (43, 44).
Soňra üç sany köpeltmek derňewinde bu 60 sany ähmiýetli panel belliklerini barladyk. CSF Copy 2-de, Emory Goizueta ADRC (17) -den 297 gözegçilik we AD nusgalarynyň garaşsyz toparyny seljermek üçin ýekeje TMT-MS ulandyk. CSF köpeltmek 3-de 120 gözegçilikden bar bolan TMT-MS maglumatlarynyň we Şweýsariýanyň Lozanna şäherinden gelen AD hassalarynyň gaýtadan analizini öz içine aldy (45). Her maglumat bazasyndaky 60 sany ähmiýetli markeriň üçden iki bölegini kesgitledik. Şweýsariýada geçirilen gözlegde dürli MS platformalary we TMT kesgitlemek usullary (45, 46) ulanylsa-da, iki gezek analizde panel tendensiýalarymyzy güýçli köpeltdik (5-nji surat, C we D, S2, I we J tablisalar). Toparymyzyň kesel aýratynlygyna baha bermek üçin, diňe gözegçilik (n = 18) we AD (n = 17) ýagdaýlary däl, eýsem PD (4) köpeltmek maglumatlary toplumyny (CSF köpeltmek 4) derňemek üçin TMT-MS ulandyk. n = 14)), ALS (n = 18) we frontotemporal demans (FTD) nusgalary (n = 11) (S1A tablisa). Bu koortdaky panel beloklarynyň üçden iki bölegini üstünlikli kesgitledik (60-dan 38-si). Bu netijeler, biomarker panelleriniň bäşisinde AD-a mahsus üýtgeşmeleri görkezýär (5E-nji surat we S2K tablisa). Metabolit toparynyň köpelmegi, iň güýçli AD aýratynlygyny görkezdi, ondan soň miýelinasiýa we glial topary bar. Az mukdarda, FTD şuňa meňzeş potensial tor üýtgemelerini görkezip bilýän bu panelleriň arasynda artmagy görkezýär (17). Munuň tersine, ALS we PD gözegçilik topary bilen birmeňzeş myelinasiýa, glial we metabolom profilini görkezdi. Umuman aýdanyňda, nusga taýýarlamagyň, MS platformasynyň we TMT kesgitlemek usullarynyň tapawudyna garamazdan, bu gaýtalanýan derňewler, ileri tutulýan panel belliklerimiziň 500-den gowrak özboluşly CSF nusgalarynda AD-a mahsus üýtgeşmeleriň bardygyny görkezýär.
AD neýrojenerleşmesi akyl alamatlarynyň döremezinden birnäçe ýyl öň giňden ykrar edildi, şonuň üçin AsymAD-yň biomarkerlerine gyssagly zerurlyk bar (5, 31). Şeýle-de bolsa, has köp subutnamalar AsymAD-yň biologiýasynyň birmeňzeş däldigini görkezýär we töwekgelçiligiň we çydamlylygyň çylşyrymly täsiri indiki keseliň ösüşinde uly tapawutlara sebäp bolýar (47). AsymAD ýagdaýlaryny kesgitlemek üçin ulanylsa-da, esasy CSF biomarkerleriniň derejeleri (Aβ1-42, jemi tau we p-tau) demansiýa (4, 7) kimiň geçjekdigini ygtybarly çaklap bilmejekdigini subut edip, has köp bolup biljekdigini görkezýär. Bu ilatyň töwekgelçiligini takyk kesgitlemek üçin beýni fiziologiýasynyň köp taraplaryna esaslanýan bitewi biomarker gurallaryny goşmak zerur. Şol sebäpden, CSF nusgasynyň 1-nji AsymAD ilatynda AD bilen tassyklanan biomarker panelimizi analiz etdik.Bu 31 AsymAD hadysasy adaty biomarker derejesini (Aβ1–42 / jemi ELISA gatnaşygy, <5.5) we doly bilimi görkezdi (MoCA, 27.1 diýmekdir) ± 2.2) (S1A tablisa). Mundan başga-da, “AsymAD” bilen kesellänleriň hemmesinde kliniki demans 0 bar, bu bolsa gündelik aň-bilim ýa-da işleýşiň peselmegine hiç hili subutnamanyň ýokdugyny görkezýär.
Ilki bilen “AsymAD” kohortyny goşmak bilen, 96 CSF-de 1-iň köpeldilen panelleriniň derejelerini analiz etdik. “AsymAD” toparyndaky birnäçe panelde AD-a meňzeş bolçulyk üýtgemeleriniň bardygyny gördük, damar paneli AsymAD-da peseliş tendensiýasyny görkezdi, beýleki panelleriň hemmesi ýokarlanmak tendensiýasyny görkezdi (6A surat). Şonuň üçin ähli paneller ELISA Aβ1-42 we umumy tau derejeleri bilen örän möhüm arabaglanyşygy görkezdi (6B surat). Munuň tersine, topar bilen MoCA balynyň arasyndaky baglanyşyk birneme pes. Bu derňewlerden has täsir galdyryjy netijeleriň biri, “AsymAD” koortundaky panelleriň köp bolmagydyr. 6A-njy suratda görkezilişi ýaly, “AsymAD” toparynyň panel derejesi, adatça ýokary üýtgeýänligi görkezip, gözegçilik toparynyň we AD toparynyň panel derejesinden geçýär. AsymAD-yň bu birmeňzeşligini has giňişleýin öwrenmek üçin 96 CSF köpeltmek 1 hadysasyna köp ölçegli masştab (MDS) derňewini ulandyk. MDS derňewi maglumatlar toplumyndaky käbir üýtgeýänlere esaslanýan ýagdaýlaryň arasyndaky meňzeşligi göz öňüne getirmäge mümkinçilik berýär. Bu klaster derňewi üçin, diňe CSF açyşynda we köpeltmek 1 proteome (n = 29) (S2L tablisa) derejesinde statistik taýdan möhüm üýtgeşmä (P <0.05, AD / gözegçilik) bar bolan tassyklanan panel belliklerini ulanýarys. Bu derňew, gözegçilik we AD ýagdaýlarymyzyň arasynda giňişleýin giňişlik döretdi (6C-nji surat). Munuň tersine, käbir “AsymAD” hadysalary gözegçilik toparynda aç-açan jemlenendir, beýlekileri AD ýagdaýlarynda ýerleşýär. Bu AsymAD birmeňzeşligini has giňişleýin öwrenmek üçin MDM kartamyzy ulanyp, bu AsymAD hadysalarynyň iki toparyny kesgitledik. Birinji topara gözegçilik (n = 19) has ýakyn toparlanan AsymAD hadysalary girýärdi, ikinji topara AD (n = 12) has ýakyn marker profili bolan AsymAD hadysalary girdi.
(A) CSF biomarker toparynyň aňlatma derejesi (z-ball), CSF köpeltmek 1 kohortdaky 96 nusgada, şol sanda AsymAD. Paneliň bol üýtgemeleriniň statistik ähmiýetine baha bermek üçin Tukiniň düzedişden soňky düzedişleri bilen tapawudyň derňewi ulanyldy. . Degişli P bahasy bilen Pearson korrelýasiýa koeffisiýenti görkezilýär. . Bu derňew, AsymAD toparyny gözegçilik (n = 19) we AD (n = 12) kiçi toparlara bölmek üçin ulanyldy. (D) Wulkan çyzgysy, iki AsymAD kiçi toparyň arasyndaky -log10 statistik P bahasyna garanyňda, log2 esse üýtgemegi (x-ok) bilen ähli CSF köpeltmek 1 belokyň diferensial aňlatmasyny görkezýär. Panel biomarkerleri reňkli. (E) CSF köpeltmek saýlama toparynyň biomarkerleriniň 1 bollyk derejesi, AsymAD kiçi toparlarynyň arasynda tapawutlanýar. Tukiniň üýtgeşiklikden soňky düzedilen derňewi statistik ähmiýete baha bermek üçin ulanyldy.
Bu gözegçilik bilen AD-a meňzeş AsimAD hadysalarynyň arasyndaky diferensial belok aňlatmasyny gözden geçirdik (6D-nji surat we S2L tablisa). Alnan wulkan kartasy, iki toparyň arasynda 14 panel markeriniň ep-esli üýtgändigini görkezýär. Bu markerleriň köpüsi sinapsyň we metabolomanyň agzalarydyr. Şeýle-de bolsa, degişlilikde miýelin we glial immun toparlarynyň agzalary bolan SOD1 we myristoýlan alanine baý belok kinaz C substraty (MARCKS) hem bu topara degişlidir (6-njy surat, D we E). Damar paneli, şeýle hem, AD ýaly AsymAD toparynda ep-esli azaldylan iki markeri goşdy, şol sanda AE baglaýjy belok 1 (AEBP1) we C9 maşgala agzasy. ELISA AB1-42 (P = 0.38) we p-tau (P = 0.28) -de gözegçilik we AD ýaly AsymAD kiçi toparlarynyň arasynda düýpli tapawut ýokdy, ýöne umumy tau derejesinde (P = 0.0031) düýpli tapawut bardy. ) (S7-nji surat). Iki AsymAD kiçi toparyň arasyndaky üýtgeşmeleriň umumy tau derejesinden has möhümdigini görkezýän birnäçe panel bellikleri bar (mysal üçin YWHAZ, SOD1 we MDH1) (6E-nji surat). Umuman aýdanyňda, bu netijeler, tassyklanan panelimizde asimptomatiki keseli bolan näsaglaryň görnüşini we potensial töwekgelçiliklerini bölüp bilýän biomarkerleriň bolup biljekdigini görkezýär.
AD-yň arkasyndaky dürli patofiziologiýany has gowy ölçemek we nyşana almak üçin ulgam esasly biomarker gurallaryna gyssagly zerurlyk bar. Bu gurallaryň diňe bir AD anyklaýyş binýadymyzy üýtgetmän, eýsem hassalara mahsus bejeriş strategiýalarynyň kabul edilmegine hem kömek etmegine garaşylýar (1, 2). Bu maksat bilen, beýnine esaslanýan patofiziologiýanyň giň gerimini görkezýän web esasly CSF biomarkerlerini kesgitlemek üçin AD beýnisine we CSF-ä bitarap giňişleýin proteomika çemeleşmesini ulandyk. Biziň derňewimiz bäş sany CSF biomarker panelini öndürdi, olar (i) sinapslary, gan damarlaryny, miýelini, immun we metabolik disfunksiýany görkezýär; (ii) dürli MS platformalarynda güýçli öndürijiligi görkezmek; (iii) ADyň irki we giçki döwürlerinde kesel bilen baglanyşykly üýtgeşmeleri görkeziň. Umuman aýdanyňda, bu tapyndylar AD gözlegleri we kliniki goşundylar üçin dürli, ygtybarly, web-gönükdirilen biomarker gurallaryny ösdürmek üçin geljegi uly ädimdir.
Netijelerimiz, AD beýni ulgamynyň proteomynyň ýokary derejede goralýan guramasyny görkezýär we ulgam esasly biomarkeriň ösüşi üçin labyr hökmünde ulanylmagyny goldaýar. Biziň seljerişimiz, AD we AsymAD beýnilerini öz içine alýan iki sany garaşsyz TMT-MS maglumat bazasynyň güýçli modullydygyny görkezýär. Bu tapyndylar, frontal, parietal we wagtlaýyn korteksde (17) 2000-den gowrak beýni dokumasynyň güýçli modullarynyň saklanmagyny görkezýän öňki işimizi uzaldýar. Bu ylalaşyk ulgamy, häzirki gözleglerde glial baý çişme modullarynyň köpelmegini we neýronlara baý modullaryň azalmagyny öz içine alýan dürli keseller bilen baglanyşykly üýtgeşmeleri görkezýär. Häzirki gözlegler ýaly, bu uly göwrümli tor, dürli dürli kliniki patofiziologiýany görkezýän AsymAD-da möhüm modul üýtgemeleri hem görkezýär (17).
Şeýle-de bolsa, ýokary konserwatiw ulgam esasly çarçuwanyň çäginde, esasanam biziň eramyzyň ilkinji döwründe şahsyýetleriň arasynda has inçe däneli biologiki birmeňzeşlik bar. Biomarker panelimiz, köp CSF markerleriniň düýpli diferensial aňlatmasyny görkezýän AsymAD-da iki kiçi topary şekillendirip bilýär. Toparymyz, AD biomarkerleriniň derejesinde aç-açan bolmadyk bu iki kiçi toparyň arasyndaky biologiki tapawudy görkezip bildi. Dolandyryş topary bilen deňeşdirilende, bu AsymAD şahsyýetleriniň Aβ1-42 / jemi tau gatnaşygy adatdan daşary pesdi. Şeýle-de bolsa, iki sany AsymAD kiçi toparyň arasynda diňe tau derejesi ep-esli tapawutlanýar, Aβ1-42 we p-tau derejeleri bolsa deňeşdirip bolýardy. CSokary CSF tau, Aβ1-42 derejesine (7) garanyňda, aň-bilim alamatlaryny has gowy çaklaýana meňzeýänligi sebäpli, iki sany AsymAD kohortynyň keseliň döremek howpy dürli bolup biler. “AsymAD” -yň çäkli nusga ululygyny we uzyn maglumatlaryň ýoklugyny göz öňünde tutup, bu netijeleri ynamly çykarmak üçin has köp gözleg gerek. Şeýle-de bolsa, bu netijeler ulgam esasly CSF paneliniň keseliň asimptomatiki döwründe şahsyýetleri netijeli bölmek ukybymyzy artdyryp biljekdigini görkezýär.
Umuman aýdanymyzda, gözleglerimiz AD patogenezinde köp biologiki funksiýanyň roluny goldaýar. Şeýle-de bolsa, tertipleşdirilen energiýa çalşygy, tassyklanan bellik panellerimiziň hemmesiniň esasy mowzugyna öwrüldi. Gipoksantin-guan fosforibosiltransferaza 1 (HPRT1) we laktat degidrojenaz A (LDHA) ýaly metabolik beloklar, AD CSF-iň ýokarlanmagynyň ýokary köpelýän jynsdygyny görkezýän iň ygtybarly sinaptiki biomarkerlerdir. Gan damarlarymyz we glial panellerimizde oksidleýji maddalaryň alyş-çalşyna gatnaşýan birnäçe bellikler hem bar. Bu tapyndylar, diňe bir neýronlaryň ýokary energiýa islegini kanagatlandyrmak bilen çäklenmän, eýsem astrositleriň we beýleki gliýal öýjükleriň ýokary energiýa islegini kanagatlandyrmak üçin metabolik prosesleriň tutuş beýnimizde oýnaýan esasy roluna laýyk gelýär (17, 48). Netijelerimiz, redoks potensialynyň üýtgemeginiň we energiýa ýollarynyň kesilmeginiň, AD patogenezine gatnaşýan birnäçe esasy prosesiň, şol sanda mitokondrial bozulmalar, glial-mediasiýa çişmesi we damar zeperlenmesiniň esasy baglanyşygy bolup biljekdigini görkezýän subutnamalary goldaýar (49). Mundan başga-da, metabolik serebrospinal suwuklyk biomarkerlerinde gözegçilik we AD ýaly AsymAD kiçi toparlarymyzyň arasynda köp sanly dürli-dürli baý beloklar bar, bu energiýanyň we redoks ýollarynyň kesilmeginiň keseliň başlangyç döwründe möhüm bolup biljekdigini görkezýär.
Syn eden beýnimiziň we serebrospinal suwuklyk paneliniň dürli ugurlary hem gyzykly biologiki täsire eýe. Neýronlara baý sinapslar we metabolomlar AD beýnisinde derejäniň peselendigini we serebrospinal suwuklygyň bollygyny görkezýär. Neýronlaryň köp sanly ýöriteleşdirilen signallary (50) üçin energiýa üpjün etmek üçin sinapslarda energiýa öndürýän mitohondriýalara baýdygyny göz öňünde tutup, bu iki neýron toparynyň aňlatma profiliniň meňzeşligine garaşylýar. Neýronlaryň ýitmegi we zeper ýeten öýjükleriň ekstruziýasy bu beýniniň we CSF paneliniň soňraky keseldäki tendensiýalaryny düşündirip biler, ýöne synlaýan irki panel üýtgeşmelerimizi düşündirip bilmezler (13). Irki asimptomatiki keselde bu tapyndylar üçin mümkin bir düşündiriş, adaty bolmadyk sinaptiki kesmekdir. Syçan modellerindäki täze subutnamalar, mikroglia bilen baglanyşykly sinaptiki fagositozyň AD-da adatdan daşary işjeňleşip, beýnide irki sinaps ýitmegine sebäp bolup biljekdigini görkezýär (51). Bu taşlanan sinaptiki material CSF-de toplanyp biler, şonuň üçin neýron panelinde CSF-iň köpelmegine syn edýäris. Immun bilen töwekgelçilikli sinaptiki kesmek, keseliň dowamynda beýnimizde we serebrospinal suwuklykda görýän glial beloklaryň köpelmegini bölekleýin düşündirip biler. Sinaptiki kesmekden başga-da, ekzositiki ýolda umumy näsazlyklar beýniniň we neýron bellikleriniň CSF aňlatmalaryna sebäp bolup biler. Birnäçe gözleg, AD beýnisiniň patogenezindäki ekzozomlaryň mazmunynyň üýtgändigini görkezdi (52). Öýjükden daşary ýol Aβ-nyň köpelmegine hem gatnaşýar (53, 54). Ekzosomal sekresiýanyň basylmagynyň AD transgen syçan modellerinde AD ýaly patologiýany azaldyp biljekdigini bellemelidiris (55).
Şol bir wagtyň özünde damar panelindäki belok AD beýnisinde ortaça ýokarlanmany görkezdi, ýöne CSF-de ep-esli azaldy. Gan-beýni barýeriniň (BBB) işlemezligi bu tapyndylary bölekleýin düşündirip biler. Köp garaşsyz postmortem adam gözlegleri AD-da BBB-iň dargamagyny görkezdi (56, 57). Bu gözlegler, endotel öýjükleriniň berk ýapylan gatlagyny gurşap alýan dürli adaty bolmadyk çäreleri tassyklady, beýniniň kapilýar syzmagy we gan bilen baglanyşykly beloklaryň perivaskulýar toplanmagy (57). Bu beýnimizdäki ýokary damar beloklary üçin ýönekeý düşündiriş berip biler, ýöne serebrospinal suwuklykda şol beloklaryň azalmagyny doly düşündirip bilmez. Bir ähtimallyk, merkezi nerw ulgamynyň çişmegi we oksidleýji stres meselesini çözmek üçin bu molekulalary işjeň izolirlemegidir. Bu paneldäki iň agyr CSF beloklarynyň azalmagy, esasanam lipoproteini kadalaşdyrmak bilen meşgullanýanlar, zyýanly çişmeleriň gadagan edilmegi we reaktiw kislorod görnüşleriniň newroprotektiki prosesi bilen baglanyşykly. Bu, aýlanyşda oksidleýji stres derejesini peseltmek üçin jogapkär lipoprotein baglaýjy ferment bolan Paroxonase 1 (PON1) üçin dogrydyr (58, 59). Alfa-1-mikroglobulin / bikunin prekursory (AMBP) damar toparynyň ep-esli pes düzgünleşdirilen belgisidir. Lipokançlygy ýok etmek we newrologiki gorag bilen meşgullanýan lipid daşaýjy bikuniniň başlangyjydyr (60, 61).
Dürli gyzykly çaklamalara garamazdan, biohimiki kesel mehanizmlerini gönüden-göni kesgitläp bilmezlik, açyşlara esaslanýan proteomika derňewiniň belli çäklendirmesidir. Şonuň üçin bu biomarker panelleriniň mehanizmlerini ynamly kesgitlemek üçin has köp gözleg gerek. MS esasly kliniki derňewiň ösüşine tarap gitmek üçin geljekki ugur, saýlama ýa-da parallel reaksiýa gözegçiligi ýaly uly göwrümli biomarker barlagy üçin maksatly mukdar usullaryny ulanmagy talap edýär (62). Recentlyakynda bu ýerde beýan edilen CSF belok üýtgeşmeleriniň köpüsini barlamak üçin paralel reaksiýa gözegçiligini (63) ulandyk. Birnäçe ileri tutulýan panel nyşanlary, degişlilikde synaps, metabolizm we çişme panellerimizi görkezýän YWHAZ, ALDOA we SMOC1 ýaly möhüm takyklyk bilen kesgitlenýär (63). Garaşsyz maglumatlary almak (DIA) we MS-e esaslanýan beýleki strategiýalar hem maksatly barlamak üçin peýdaly bolup biler. Bud we ş.m. . Bu soňky gözlegler panellerimiziň ygtybarly MS esasly kesgitlemesine öwrülmek mümkinçiligini goldaýar. Adaty antikor we aptamer esasly kesgitlemek, esasy AD biomarkerleriniň mundan beýläk-de ösmegi üçin möhümdir. CSF-iň azlygy sebäpli, ýokary geçişli MS usullaryny ulanyp, bu biomarkerleri ýüze çykarmak has kyn. NEFL we NRGN, az mukdarda CSF biomarkerleriniň şeýle iki mysalydyr, olar giňişleýin derňewimizde panele düzülendir, ýöne ýeke-täk MS strategiýamyzy ulanyp ygtybarly kesgitläp bolmaz. PEA ýaly birnäçe antikorlara esaslanýan strategiýalar, bu markerleriň kliniki üýtgemegine kömek edip biler.
Umuman aýdanyňda, bu gözleg dürli ulgamlara esaslanýan CSF AD biomarkerlerini kesgitlemek we barlamak üçin özboluşly proteomika çemeleşmesini üpjün edýär. Goşmaça AD kohortlary we MS platformalary boýunça bu marker panellerini optimizirlemek, AD töwekgelçiligini we bejergisini öňe sürjekdigini görkezýär. Wagtyň geçmegi bilen bu panelleriň uzynlyk derejesine baha berýän gözlegler, markerleriň haýsy kombinasiýasynyň irki kesel töwekgelçiligini we keseliň agyrlygynyň üýtgemegini kesgitlemek üçin möhümdir.
CSF tarapyndan göçürilen 3 nusgadan başga, bu işde ulanylan ähli CSF nusgalary Emory ADRC ýa-da ýakyndan baglanyşykly gözleg edaralarynyň howandarlygynda ýygnaldy. Bu proteomika gözleglerinde jemi dört toplum Emory CSF nusgasy ulanyldy. CSF toparynda 20 sagdyn gözegçilikden we 20 AD hassasyndan nusgalar bar. CSF 1-nji nusgada 32 sagdyn gözegçilik, 31 sany AsymAD şahsyýeti we 33 AD şahsyýeti bar. CSF 2-nji nusgada 147 gözegçilik we 150 AD nusgasy bar. Köp keselli CSF köpeltmek 4 kohortda 18 gözegçilik, 17 AD, 19 ALS, 13 PD we 11 FTD nusgasy bar. Emory uniwersitetiniň institusional gözden geçiriş geňeşi tarapyndan tassyklanan şertnama laýyklykda, Emory okuwyna gatnaşanlaryň hemmesi habarly razylyk aldylar. Alsgeýmer merkezleri üçin 2014-nji ýyldaky Milli Garrylyk Institutynyň iň oňat tejribe görkezmelerine (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) görä, serebrospinal suwuklyk lomber deşik bilen ýygnalyp saklanýar. Dolandyryş we AsymAD we AD hassalary Emory Biliş Newrologiýa Klinikasynda ýa-da Goizueta ADRC-de standart bilim derejesini aldylar. Olaryň serebrospinal suwuklyk nusgalary INNO-BIA AlzBio3 Luminex tarapyndan ELISA Aβ1-42, umumy tau we p-tau derňewi üçin synag edildi (65). ELISA bahalary, AD biomarkeriň kesilen kriteriýalaryna esaslanýan predmetleriň diagnostika klassifikasiýasyny goldamak üçin ulanylýar (66, 67). Beýleki CSF diagnozlary (FTD, ALS we PD) üçin esasy demografiki we anyklaýyş maglumatlary Emory ADRC ýa-da baglanyşykly gözleg edaralaryndan hem alynýar. Bu Emory CSF ýagdaýlary üçin gysgaça maglumat meta-maglumatyny S1A tablisasynda tapyp bilersiňiz. Şweýsariýanyň CSF köpeltmek 3 kohortynyň aýratynlyklary öň neşir edildi (45).
CSF nusgany tapdy. CSF maglumatlar toplumyny açmagymyzyň çuňlugyny ýokarlandyrmak üçin, tripsinizasiýa başlamazdan ozal köp mukdarda beloklaryň immun sarp edilişi geçirildi. Gysgaça aýdanyňda, 40 sany aýratyn CSF nusgasyndan 130 μl CSF we deň mukdarda (130 μl) ýokary saýlama Top14 bolçulykdaky beloklaryň azalmagy rezini (Termo Fisher Scientific, A36372) otagda aýlaw sütünine ýerleşdirildi (Termo Fisher Scientific, A89868). temperatura inkubate). 15 minut aýlanandan soň, nusgany 1000g derejesinde 2 minut merkezleşdiriň. 3K ultrases merkezden gaçyryş süzgüç enjamy (Millipore, UFC500396), 14,000g 30 minutda merkezden gaçyryş serişdesini jemlemek üçin ulanyldy. Amplehli nusga göwrümlerini fosfat buferli duz bilen 75 μl çenli garyşdyryň. Beloklaryň konsentrasiýasy öndürijiniň teswirnamasyna (Termo Fisher Scientific) laýyklykda bikinhon kislotasy (BCA) usuly bilen baha berildi. 40 nusgadan immunodepletirlenen CSF (60 μl) lizil endopeptidaza (LysC) we tripsin bilen siňdirildi. Gysgaça aýdylanda, nusga azaldyldy we 1,2 μl 0,5 M tris-2 (-karboksietil) -fosfin we 3 μl 0.8 M hloroasetamid 90 ° C-de 10 minutda azaldyldy we 15 minut suw wannasynda sonikasiýa edildi. Nusga 193 μl 8 M karbamid buferi [8 M karbamid we 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] bilen 6 M karbamidiň soňky konsentrasiýasyna çenli garyndy. LysC (4,5 μg; Wako) otag temperaturasynda gijeki iýmit siňdiriş üçin ulanylýar. Soňra nusga 50 m ammiak bikarbonat (ABC) (68) bilen 1 M karbamid bilen garyndy. Deň mukdarda (4,5 μg) tripsin (Promega) goşuň we nusgany 12 sagatlap inkubasiýa ediň. Iýmit siňdirilen peptid erginini 1% formik kislotanyň (FA) we 0,1% trifloroasetik kislotanyň (TFA) (66) iň soňky konsentrasiýasyna kislotalaşdyryň, soňra ýokarda görkezilişi ýaly 50 mg Sep-Pak C18 sütüni (Suw) bilen duzlaň. . Soňra peptid 1 ml 50% asetonitril (ACN) bilen çykaryldy. Toparlaryň (25) belok mukdaryny standartlaşdyrmak üçin, 40 CSF nusgasyndan 100 alik alikot garyşyk nusga döretmek üçin birleşdirildi, soňra bäş sany global içerki standart (GIS) (48) nusgalara bölündi. Individualhli aýratyn nusgalar we birleşdirilen standartlar ýokary tizlikli wakuum (Labconco) bilen guradylýar.
CSF nusgany göçürýär. Daýon we kärdeşleri ozal immunitetiň azalmagyny we CSF nusgasynyň 3 nusgasyny siňdirmegi beýan etdiler (45, 46). Galan köpeldilen nusgalar aýratyn immunodeplirlenmedi. Bu aýyrylmadyk nusgalary öň beýan edilişi ýaly tripsinde siňdiriň (17). Her gezek gaýtalanýan derňew üçin, her nusgadan çykarylan peptidiň 120 μl alikotlary birleşdirilip, TMT belgili global içerki standart hökmünde ulanmak üçin deň göwrümli alikotlara bölündi (48). Individualhli aýratyn nusgalar we birleşdirilen standartlar ýokary tizlikli wakuum (Labconco) bilen guradylýar. Az mukdarda CSF belogynyň signalyny güýçlendirmek üçin, her nusgadan 125 μl birleşdirip, her köpeltmek derňewi üçin “güýçlendirilen” nusga taýýarlandy, ýagny gözleg nusgasyna meňzeýän biologiki nusga, ýöne bar bolan mukdar bar has uly (37, 69)] garyşyk CSF nusgasyna birleşdirildi (17). Soňra garyşyk nusga, ýokarda görkezilişi ýaly siňdirilen we soňraky birnäçe TMT belliklerine goşulan “High Select Top14” köp mukdarda belok aýyrmak rezini (Termo Fisher Scientific, A36372) ulanyp, immuniteti ýok edildi.
Iş wagty: 27-2021-nji awgust