Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň. Ulanylýan brauzer wersiýaňyzyň çäkli CSS goldawy bar. Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň). Şol aralykda, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript bolmazdan hödürläris.
Termofiller ýokary temperaturada ösýän mikroorganizmlerdir. Olary öwrenmek, durmuşyň aşa şertlere nädip uýgunlaşýandygy barada gymmatly maglumatlary berip biler. Şeýle-de bolsa, adaty optiki mikroskoplar bilen ýokary temperatura şertlerine ýetmek kyn. Reserli garşylykly elektrik ýyladyşyna esaslanýan öýde öndürilen birnäçe çözgüt teklip edildi, ýöne ýönekeý täjirçilik çözgüdi ýok. Bu ýazgyda, ulanyjynyň gurşawyny ýumşak saklamak bilen, termofil barlaglary üçin ýokary temperaturany üpjün etmek üçin mikroskop meýdançasynda mikroskale lazer bilen ýylatmak düşünjesini hödürleýäris. Orta lazer intensiwliginde mikroskaly ýyladyş, biokompatif we täsirli ýagtylyk sorujy hökmünde altyn nanobölejik bilen örtülen substraty ulanyp bolýar. Mikroskale suwuklygyň konweksiýasynyň, öýjükleriň saklanmagynyň we merkezden gaçyryş termoforetiki hereketiniň bolup biljek täsirleri ara alnyp maslahatlaşylýar. Bu usul iki görnüşde görkezildi: (i) mikroskaly ýyladyşda gögerip, ösüp we ýüzmek üçin syn eden takmynan 65 ° C-de köpelýän işjeň termofil bakteriýasy Geobacillus stearothermophilus; (ii) optimal gipertermofil arheýa bolan Tiobacillus sp. 80 ° C. Bu iş häzirki zaman we elýeterli mikroskopiýa gurallaryny ulanyp, termofil mikroorganizmlere ýönekeý we ygtybarly gözegçilik etmek üçin ýol açýar.
Millionlarça ýyl bäri Eartherdäki ýaşaýyş käwagt adamzat nukdaýnazaryndan aşa aşa hasaplanýan daşky gurşaw şertleriniň köpüsine uýgunlaşdy. Hususan-da, termofiller diýilýän käbir termofil mikroorganizmler (bakteriýalar, arhaýa, kömelekler) 45 ° C-den 122 ° C1, 2, 3, 4. temperatura aralygynda gülläp ösýär. Termofiller dürli deňiz ekosistemalarynda, çuňňur deňiz gidrotermiki şemallary, gyzgyn çeşmeler ýaly ýaşaýar. ýa-da wulkan ýerleri. Gözlegleri, soňky iki onýyllygyň içinde azyndan iki sebäbe görä uly gyzyklanma döretdi. Ilki bilen, meselem, 5, 6, 7, 8 fermentleri we 9 membranalary şeýle ýokary temperaturada durnuklydygyny ýa-da termofilleriň aşa ýokary radiasiýa garşy durup biljekdigini öwrenip bileris10. Ikinjiden, ýangyç öndürmek13,14,15,16, himiki sintez (dihidro, spirtler, metan, aminokislotalar we ş.m.) 17, biomining18 we termostable biokatalizatorlar ýaly möhüm biotehnologiki goşundylar üçin esas bolup durýar. 13. Hususan-da, häzirki wagtda belli bolan polimeraza zynjyryň reaksiýasy (PCR) 19, ilkinji açylan termofilleriň biri bolan termofil bakteriýasy Thermus aquaticus-dan izolirlenen fermenti (Taq polimeraza) öz içine alýar.
Şeýle-de bolsa, termofilleri öwrenmek aňsat iş däl we haýsydyr bir biologiki barlaghanada döredilip bilinmez. Hususan-da, adatça 40 ° C-den pes temperaturada bahalandyrylýan täjirçilik elýeterli ýyladyş kameralary bilen hem adaty termiki mikroskop bilen janly termofilleri synlap bolmaýar. 1990-njy ýyllardan başlap, diňe birnäçe gözleg topary ýokary temperaturaly mikroskopiýa (HTM) ulgamlaryny ornaşdyrmaga bagyşlandy. 1994-nji ýylda Glukh we başg. Heatingyladyş / sowadyş kamerasy, anaerobitligi 20 saklamak üçin ýapylan gönüburçly kapilýilleriň temperaturasyna gözegçilik edýän Peltier öýjüginiň ulanylmagy esasynda döredildi. Enjam 2 ° C / s tizlik bilen 100 ° C çenli gyzdyrylyp bilner, bu awtorlara gipertermofil bakteriýasynyň Termotoga maritima21 hereketini öwrenmäge mümkinçilik berýär. 1999-njy ýylda Horn we başg. Öýjükleriň bölünişigini / baglanyşygyny öwrenmek üçin täjirçilik mikroskopiýa üçin laýyk gyzdyrylan kapilýilleriň ulanylmagyna esaslanýan gaty meňzeş enjam döredildi. Uzak wagtlap otnositel hereketsizlikden soň, täsirli HTM-leri gözlemek 2012-nji ýylda, hususan-da Horn we başganyň oýlap tapan enjamyny ulanan Wirth toparynyň birnäçe kagyzlary bilen baglanyşykly täzeden başlandy. On bäş ýyl ozal, gipertermofilleri goşmak bilen köp sanly arhaýanyň hereketi, gyzdyrylan kapilýallary ulanyp, 100 ° C çenli temperaturada öwrenildi23,24. Şeýle hem has çalt gyzdyrmak (kesgitlenen temperatura ýetmek üçin 35 minutyň ýerine birnäçe minut) we ortaça 2 sm-den gowrak çyzykly temperatura gradiýentine ýetmek üçin asyl mikroskopy üýtgetdiler. Bu temperatura gradient şekillendiriş enjamy (TGFD) 24, 25 aralygynda biologiki taýdan uzak aralyklarda temperatura gradiýentleriniň içindäki köp termofilleriň hereketini öwrenmek üçin ulanyldy.
Closedapyk kapilýarlary gyzdyrmak, janly termofilleri synlamagyň ýeke-täk usuly däl. 2012-nji ýylda Kuwabara we başg. Heatylylyga çydamly ýelim bilen möhürlenen öýde ulanylýan bir gezek ulanylýan Pyrex kameralary ulanyldy (Super X2; Cemedine, Japanaponiýa). Nusgalar 110 ° C-e çenli gyzdyryp bilýän, ýöne aslynda bioimage üçin niýetlenen täjirçilik taýdan açyk ýyladyş plastinkasyna (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japanaponiýa) ýerleşdirildi. Authorsazyjylar anaerob termofil bakteriýalarynyň (Termosipho globiformans, 24 esse iki esse) 65 ° C-de netijeli bölünişine syn etdiler. 2020-nji ýylda Pulşen we başgalar. Söwda metal gap-gaçlary netijeli ýylatmak (AttofluorTM, Thermofisher) öýde ýasalan iki ýyladyş elementini ulanyp görkezildi: gapak we basgançak (PCR maşyn bilen ylhamlanan konfigurasiýa). Bu birleşme, suwuklygyň birmeňzeş temperaturasyna getirýär we gapagyň aşagyndaky bugarmagyň we kondensatyň öňüni alýar. O halkasynyň ulanylmagy daşky gurşaw bilen gaz çalşygynyň öňüni alýar. Sulfoskop diýlip atlandyrylýan bu HTM, 75 ° C27 derejesinde Sulfolobus asidokaldariusy şekillendirmek üçin ulanyldy.
Bu ulgamlaryň hemmesiniň ykrar edilen çäklendirmesi, howa maksatlarynyň ulanylmagyny çäklendirmekdi, şeýle ýokary temperatura üçin we 1 mm galyňlykdaky aç-açan nusgalarda surata düşmek üçin islendik ýag çümdürilmegi. Bu ulgamlaryň hemmesiniň ykrar edilen çäklendirmesi, howa maksatlarynyň ulanylmagyny çäklendirmekdi, şeýle ýokary temperatura üçin we 1 mm galyňlykdaky aç-açan nusgalarda surata düşmek üçin islendik ýag çümdürilmegi. Общепризныным недостатком всех этих было ограничение на использование воздушных ока овов, поскольку любое иммер черное погружение в масло не подходило для тако вычы Bu ulgamlaryň hemmesiniň ykrar edilen kemçiligi, howa maksatlarynyň ulanylmagyny çäklendirmekdi, sebäbi islendik ýag çümdürilmegi beýle ýokary temperatura we aç-açan nusgalar arkaly> 1 mm galyňlykda görünmek üçin amatly däldi.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1 毫米厚的透明样品成像。 Bu ulgamlaryň hemmesiniň ykrar edilen çäklendirmesi, howa bilen örtülen aýnany ulanmagyň çäklendirilmegi bolup durýar, sebäbi şeýle ýokary temperaturada 1 mm galyňlykda aýdyň nusgalary surata almak üçin islendik ýag çümdürilmegi ýaramly däl. Общепризнанным недостатком всех этих является ограниченное использование воздушных об адов, любое иммер черное погружение в масло непригодно для таких вискоких зы Bu ulgamlaryň hemmesiniň ykrar edilen kemçiligi, howa linzalarynyň çäkli ulanylmagydyr, islendik ýag çümdürilmegi şeýle ýokary temperatura we 1 mm galyňlykdaky aç-açan nusgalar arkaly görmek üçin ýaramly däl.Recentlyaňy-ýakynda bu çäklendirmäni Çarlz-Orzag we başg. 28, indi gyzyklanma ulgamynyň töwereginde ýylylygy üpjün etmeýän, tersine, ITO-dan (indiý-gala oksidi) ýasalan rezistoryň inçe açyk gatlagy bilen örtülen aýnanyň içinde. Gapagy, açyk gatlakdan elektrik toguny geçirip, 75 ° C çenli gyzdyryp bolýar. Şeýle-de bolsa, awtor obýekti zaýalamazlyk üçin obýekti 65 ° C-den ýokary bolmaly däldir.
Bu işler, ýokary temperaturaly optiki mikroskopiýanyň ösdürilmeginiň giňden kabul edilmändigini, köplenç öýde ýasalan enjamlary talap edýändigini we termofil mikroorganizmleriň birinden uly däldigini göz öňünde tutup, giňişlik çözgüdi bilen gazanylýandygyny görkezýär. mikrometrler. Heatingyladyş göwrüminiň peselmegi HTM-iň üç sany mahsus meselesini çözmegiň açarydyr: giňişlik çözgüdi pes, ulgam gyzdyrylanda ýokary termiki inersiýa we aşa temperaturada daş-töweregi elementleri zyýanly gyzdyrmak (çümdüriliş ýagy, obýektiw linzalar ... ýa-da ulanyjylaryň eli). ).
Bu kagyzda, garşylykly ýyladyşa esaslanmaýan termofile gözegçilik üçin HTM hödürleýäris. Muňa derek, mikroskopyň çäkli çäginde ýagtylyk siňdiriji substratyň lazer şöhlelenmesi bilen lokallaşdyrylan ýyladyşy gazandyk. Temperaturanyň paýlanyşy mukdar faza mikroskopiýasy (QPM) arkaly şekillendirildi. Bu usulyň täsirliligi, takmynan 65 ° C-de köpelýän we gysga iki esse (20 minut töweregi) hereket edýän termofil bakteriýasy Geobacillus stearothermophilus we 80 ° C-de optimal ösýän gipertermofil Sulfolobus şibata bilen görkezilýär. suratlandyrmak üçin. Adaty köpeltmek tizligi we suwda ýüzmek, temperaturanyň funksiýasy hökmünde syn edildi. Bu lazer HTM (LA-HTM) örtügiň galyňlygy ýa-da obýektiň tebigaty (howa ýa-da ýag çümdürilmegi) bilen çäklenmeýär. Bu bazardaky islendik ýokary çözgütli linzany ulanmaga mümkinçilik berýär. Şeýle hem termiki inersiýa sebäpli haýal ýyladyşdan ejir çekmeýär (millisekunt şkalasynda derrew gyzdyrmagy gazanýar) we diňe täjirçilik taýdan ulanylýan komponentleri ulanýar. Howpsuzlygyň ýeke-täk aladasy enjamyň içinde güýçli lazer şöhleleriniň (adatça 100 mWt) bolmagy we gorag äýnegini talap edýän gözler bilen baglanyşyklydyr.
LA-HTM ýörelgesi, mikroskopyň çäginde nusgany ýerli derejede gyzdyrmak üçin lazer ulanmakdyr (1a surat). Munuň üçin nusga ýeňil siňdiriji bolmaly. Amatly lazer güýjüni (100 mWt-dan az) ulanmak üçin, ýagtylygyň suwuk gurşaw bilen siňmegine bil baglamadyk, ýöne substraty altyn nanobölejikler bilen örtüp, nusganyň siňdirilmegini emeli usulda artdyrdyk (1-nji surat). Altyn nanobölejikleri ýagtylyk bilen gyzdyrmak, biomedisina, nanokimiýa ýa-da gün şöhlesini ýygnamakda garaşylýan amaly 29,30,31 ýylylyk plazmonikasy üçin möhüm ähmiýete eýe. Soňky birnäçe ýylda bu LA-HTM-ni fizika, himiýa we biologiýa boýunça termiki plazma amaly bilen baglanyşykly birnäçe gözlegde ulandyk. Bu usul bilen esasy kynçylyk, soňky temperatura profilini görkezmekdir, sebäbi ýokarlanan temperatura nusgadaky mikroskale sebiti bilen çäklenýär. Dört tolkun uzynlygyndaky transvers gyrkym interferometri, ýönekeý, ýokary çözgütli we iki ölçegli difraksiýa panjaralaryny ulanmagyň esasynda mukdar faza mikroskopiýasynyň örän duýgur usuly bilen temperatura kartasyny düzüp boljakdygyny görkezdik. 33,34,35,36. Geçirilen tolkun tolkunly mikroskopiýa (CGM) esaslanan bu termiki mikroskopiýa usulynyň ygtybarlylygy, soňky on ýylda çap edilen onlarça kagyzda görkezildi37,38,39,40,41,42,43.
Paralel lazer bilen ýyladyş, şekil we temperatura mikroskopyny gurmagyň shemasy. b Altyn nanobölejikler bilen örtülen örtükli AttofluorTM kamerasyndan ybarat geometriýa. c Nusga ýakyndan serediň (masştablandyrmaly däl). d birmeňzeş lazer şöhleleriniň profilini we (e) altyn nanobölejikleriň nusga tekizliginde soňraky temperatura paýlanyşyny aňladýar. f (g) -de görkezilen temperatura paýlanyşynyň simulýasiýasynda görkezilişi ýaly birmeňzeş temperatura döretmek üçin amatly ýyllyk lazer şöhle profilidir. Tereziniň çyzgysy: 30 µm.
Hususan-da, ýaňy-ýakynda LA-HTM we CGM bilen süýdemdiriji öýjükleriň gyzdyrylmagyny gazandyk we 37-42 ° C aralygynda öýjükli ýylylyk zarbasyny yzarladyk, bu usulyň ýeke janly öýjük şekillendirişine degişlidigini görkezdik. Şeýle-de bolsa, ýokary temperaturada mikroorganizmleri öwrenmek üçin LA-HTM-iň ulanylmagy birmeňzeş däl, sebäbi süýdemdiriji öýjükler bilen deňeşdirilende has seresaplylygy talap edýär: birinjiden, orta düýbüni onlarça dereje gyzdyrmak (birnäçe dereje däl) güýçli dik temperatura gradiýentine. Substrata berk ýapylmasa, islenilmeýän herekete we bakteriýalaryň garyşmagyna sebäp bolup biljek 44 suwuk konweksiýa döredip biler. Bu konweksiýa suwuk gatlagyň galyňlygyny azaltmak arkaly ýok edilip bilner. Bu maksat bilen, aşakda görkezilen synaglaryň hemmesinde, demir käsäniň içinde takmynan 15 µm galyňlykda iki gapagyň arasynda bakteriýa süspensiýalary goýuldy (AttofluorTM, Termofişer, 1b surat, c). Aslynda, suwuklygyň galyňlygy ýyladyş lazeriniň şöhlelerinden has kiçi bolsa, konweksiýanyň öňüni alyp bolar. Ikinjiden, şeýle çäkli geometriýada işlemek aerob organizmleri bogup biler (S2-nji surata serediň). Kislorodyň (ýa-da başga bir möhüm gazyň) geçirijilikli substratyny ulanmak, gapagyň içine duzakly howa köpürjiklerini goýmak ýa-da ýokarky gapakdaky deşikleri burawlamak arkaly bu meseläniň öňüni alyp bolar (S1-nji surata seret) 45. Bu gözlegde, soňky çözgüdi saýladyk (1b we S1 suratlar). Netijede, lazer bilen ýyladyş birmeňzeş temperatura paýlanyşyny üpjün etmeýär. Lazer şöhlesiniň şol bir intensiwliginde-de (1-nji surat) temperaturanyň paýlanyşy birmeňzeş däl, termiki diffuziýa sebäpli Gaussyň paýlanyşyna meňzeýär (1e surat). Haçan-da maksat biologiki ulgamlary öwrenmek üçin takyk temperaturany kesgitlemek bolanda, deň bolmadyk profiller ideal däl we substrata ýapyşmasa bakteriýalaryň termoforetiki hereketine sebäp bolup biler (S3, S4 surata serediň) 39. Bu maksat bilen, belli bir geometrik meýdanyň içinde birmeňzeş temperatura paýlanyşyny gazanmak üçin nusganyň tekizliginde halkanyň şekiline (1-nji surat) infragyzyl lazer şöhlesini şekillendirmek üçin giňişlik ýagtylyk modulýatoryny (SLM) ulandyk, malylylyk diffuziýasyna garamazdan (1-nji surat) 39, 42, 46 Bu ýokarky gapagyň möhürlenmändigi sebäpli, zerur bolsa goşmaça gurşaw islendik wagt aňsatlyk bilen goşulyp bilner.
LA-HTM-iň işleýşini we termofil gözleginde ulanylyşyny görkezmek üçin 60-65 ° C töweregi optimal ösüş temperaturasy bolan aerob bakteriýalary Geobacillus stearothermophilus-y öwrendik. Şeýle hem bakteriýa flagella we ýüzmek ukybyna eýe bolup, adaty öýjükli işjeňligiň başga bir görkezijisini üpjün edýär.
Nusgalar (1b surat) 60 ° C-den öň bir sagatlap inkubasiýa edildi, soň bolsa LA-HTM nusga saklaýjysyna ýerleşdirildi. Bu inkubasiýa deslapky, iki sebäbe görä islege bagly, ýöne şonda-da peýdaly: Birinjiden, lazer açylanda öýjükleriň derrew ösmegine we bölünmegine sebäp bolýar (Goşmaça materiallarda M1 filmine serediň). Inkubasiýa edilmezden, bakteriýalaryň ösüşi adatça her gezek täze tomaşa meýdançasy gyzdyrylanda takmynan 40 minut gijikdirilýär. Ikinjiden, inkubasiýa edilmezinden 1 sagat öň bakteriýalaryň gapak ýapgysyna ýapyşmagyna kömek etdi, lazer açylanda termoforez sebäpli öýjükleriň meýdançadan çykmagynyň öňüni aldy (Goşmaça materiallarda M2 filmine serediň). Termoforez bölejikleriň ýa-da molekulalaryň temperatura gradiýenti boýunça hereketidir, adatça yssydan sowuga çenli, bakteriýalar hem 43,47 däl. Bu islenmeýän täsir, lazer şöhlesini emele getirmek we tekiz temperatura paýlanyşyny gazanmak üçin SLM ulanyp, belli bir sebitde ýok edilýär.
Injirde. 2-nji suratda altyn nanobölejikler bilen örtülen aýna substraty ýyllyk lazer şöhlesi bilen şöhlelendirmek arkaly alnan CGM bilen ölçelýän temperatura paýlanyşy görkezilýär (1-nji surat). Lazer şöhlesi bilen örtülen tutuş meýdanda tekiz temperatura paýlanyşy syn edildi. Bu zona iň amatly ösüş temperaturasy 65 ° C boldy. Bu sebitiň daşyndaky temperatura egrisi tebigy ýagdaýda \ (1 / r \) düşýär (bu ýerde \ (r \) radial koordinatasy).
Tegelek meýdanda tekiz temperatura profilini almak üçin altyn nanobölejikleriň bir gatlagyny şöhlelendirmek üçin ýyllyk lazer şöhlesini ulanmak arkaly alnan CGM ölçegleriniň temperatura kartasy. b Temperatura kartasynyň izotermi (a). Lazer şöhlesiniň kontury çal reňkli tegelek şekillendirilýär. Synag iki gezek gaýtalandy (Goşmaça materiallar, S4 surata serediň).
Bakteriýa öýjükleriniň ýaşaýyş ukyby LA-HTM ulanyp birnäçe sagatlap gözegçilik edildi. Injirde. 3, 3 sagat 20 minutlyk filmden alnan dört surat üçin wagt aralygyny görkezýär (Kino M3, Goşmaça maglumatlar). Bakteriýalaryň, temperaturanyň iň amatly ýerinde, 65 ° C-e ýakynlaşýan lazer bilen kesgitlenen tegelek meýdanyň içinde işjeň köpelýändigi synlandy. Munuň tersine, temperatura 10 s üçin 50 ° C-den aşak düşende öýjükleriň ösüşi ep-esli azaldy.
Dürli döwürde lazer gyzdyrylandan soň ösýän G. stearotermofil bakteriýalarynyň optiki çuňluk şekilleri, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min. 200 Bir minutlyk filmden alyndy (Goşmaça maglumatlarda berlen M3 film) degişli temperatura kartasynda ýerleşdirildi. Lazer wagtynda açylýar \ (t = 0 \). Izotermler intensiwlik şekiline goşuldy.
Öýjükleriň ösüşini we temperatura baglylygyny has-da kesgitlemek üçin, M3 film meýdançasynda ilkibaşda izolirlenen bakteriýalaryň dürli koloniýalarynyň biomassasynyň ýokarlanmagyny ölçedik (4-nji surat). Mini koloniýany emele getirýän bölümiň (mCFU) emele gelmeginiň başynda saýlanan esasy bakteriýalar S6-njy suratda görkezilýär. Gury köpçülik ölçegleri, temperaturanyň paýlanyşyny kartalaşdyrmak üçin ulanylýan CGM 48 kamerasy bilen alyndy. CGM-iň gury agramy we temperaturany ölçemek ukyby LA-HTM-iň güýji. Garaşylyşy ýaly, ýokary temperatura bakteriýalaryň has çalt ösmegine sebäp boldy (4a surat). 4b-nji suratda ýarym log sýu plotetinde görkezilişi ýaly, ähli temperaturalarda ösüş ekspensial ösüşden soň bolýar, bu ýerde maglumatlar ekspensial funksiýany ulanýar \ (m = {m} _ {0} {10} ^ {t / \ tau} + {{\ mbox {cst}}} \), bu ýerde \ (\ tau {{{{{\ rm {log}}}}} \ 2 \) - nesil wagty (ýa-da iki esse köp), \ (g = 1 / \ tau \) - ösüş depgini (birlik wagty bölünişleriň sany). Injirde. 4c, temperaturanyň funksiýasy hökmünde degişli ösüş depginini we nesil wagtyny görkezýär. Çalt ösýän mCFU-lar, iki sagatdan soň ösüşiň doýmagy, bakteriýalaryň dykyzlygy sebäpli garaşylýan özüni alyp barmak bilen häsiýetlendirilýär (nusgawy suwuk medeniýetlerde stasionar faza meňzeýär). Umumy görnüşi \ (g \ çep (T \ sag) \) (4-nji surat) 60-65 ° C töweregi optimal ösüş depgini bolan G. stearotermofil üçin garaşylýan iki fazaly egrä laýyk gelýär. Maglumatlary kardinal model (S5 surat) 49 bilen deňeşdiriň, bu ýerde \ (\ çep ({{G} _ {0} {; \; T}} _ {{\ min}}; {T} _ {{opt}}) ; {T} _ {{\ max}} \ sag) \) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) ° C, bu edebiýatda görkezilen beýleki gymmatlyklar bilen oňat ylalaşýar49. Temperatura bagly parametrler köpelip bilýän hem bolsa, iň ýokary ösüş tizligi \ ({G} _ {0} \) bir synagdan başga birine üýtgäp biler (S7-S9 suratlaryna we M4 filmine serediň). Universalhliumumy bolmaly temperatura laýyklyk parametrlerinden tapawutlylykda, iň ýokary ösüş depgini gözegçilik edilýän mikroskale geometriýasynyň içindäki serişdelere (ýokumly maddalaryň, kislorodyň konsentrasiýasyna) baglydyr.
dürli temperaturalarda mikrob ösüşi. mCFU: Miniatýur koloniýany emele getirýän bölümler. Temperatura gradiýentinde ösýän ýekeje bakteriýanyň wideosyndan alnan maglumatlar (M3 film). b (a) bilen deň, ýarym logarifmiki masştab. c Ösüş tizligi \ (\ tau \) we çyzykly regressiýadan (b) hasaplanan nesil wagty \ (g \). Gorizontal säwlik barlary: ösüş döwründe mCFU-laryň giňelýän temperatura diapazony. Dik ýalňyşlyk setirleri: çyzykly regressiýa standart ýalňyş.
Adaty ösüşden başga-da, käbir bakteriýalar flagella bilen bakteriýalara garaşylýan häsiýet bolan lazer gyzdyrylanda kämahal ýüzýärdi. Goşmaça maglumatdaky M5 filmi şeýle ýüzmek çärelerini görkezýär. Bu synagda, 1d, e we S3 suratlarda görkezilişi ýaly temperatura gradiýentini döretmek üçin birmeňzeş lazer radiasiýasy ulanyldy. 5-nji suratda M5 filminden saýlanan iki sany yzygiderlilik görkezilýär, bir bakteriýa ugrukdyryjy hereket görkezýär, beýleki bakteriýalar hereketsiz galýar.
Iki wagt çarçuwasy (a) we (b) punktir tegelekler bilen bellenen iki dürli bakteriýanyň ýüzmegini görkezýär. Suratlar M5 filminden alyndy (goşmaça material hökmünde berilýär).
G. stearothermophilus ýagdaýynda bakteriýalaryň işjeň hereketi (5-nji surat) lazer şöhlesi açylandan birnäçe sekunt soň başlandy. Bu gözegçilik, bu termofil mikroorganizmiň Mora we başganyň eýýäm syn edişi ýaly temperaturanyň ýokarlanmagyna wagtlaýyn jogap bermegini nygtaýar. 24. Bakteriýalaryň hereketi we hatda termotaksis mowzugy LA-HTM ulanyp hasam öwrenilip bilner.
Mikrobda ýüzmek, fiziki hereketiň beýleki görnüşleri bilen garyşdyrylmaly däldir, ýagny (i) belli bir ugry bolmadyk bulam-bujar hereket ýaly görünýän Brownian hereketi, (ii) 50 konweksiýa we termoforez 43, temperatura boýunça yzygiderli hereket etmekden ybarat; gradient.
G. stearothermophilus gorag hökmünde oňaýsyz daşky gurşaw şertlerine sezewar bolanda ýokary çydamly sporalary (sporanyň emele gelmegi) öndürmek ukyby bilen tanalýar. Daşky gurşaw şertleri täzeden amatly bolanda sporlar gögerip, janly öýjükleri emele getirýär we ösüşi dowam etdirýär. Bu sporulýasiýa / gögeriş prosesi belli bolsa-da, hakyky wagtda hiç wagt görülmedi. LA-HTM ulanyp, bu ýerde G. stearothermophilus-da gögeriş hadysalaryna ilkinji synlamany habar berýäris.
Injirde. 6a 13 sporanyň CGM toplumyny ulanyp alnan optiki çuňlugyň (OT) wagtlaýyn şekillerini görkezýär. Collectionhli ýygnamak wagty (15 sagat 6 minut, \ (t = 0 \) - lazer bilen gyzdyrmagyň başlangyjy), 13 sporadan 4-si yzygiderli wagt nokatlarynda gögerýär \ (t = 2 \) h, \ (3 \ ) h \ (10 \) ', \ (9 \) h \ (40 \)' we \ (11 \) h \ (30 \) '. Bu wakalaryň diňe biri 6-njy suratda görkezilse-de, goşmaça materialda M6 filminde 4 gögeriş hadysasyny synlamak bolýar. Gyzykly tarapy, gögeriş tötänleýin bolup görünýär: daşky gurşawyň üýtgemegine garamazdan, sporlaryň hemmesi gögermeýär we şol bir wagtyň özünde gögermeýär.
8 OT şekilinden (ýag çümdürilmegi, 60x, 1.25 NA maksat) we (b) G. stearotermofil agregatlarynyň biomassasy ewolýusiýasyndan ybarat wagt aralygy. c (b) Ösüş depgininiň çyzyklylygyny görkezmek üçin ýarym gündelik şkalada çyzylan.
Injirde. 6b, c maglumatlary ýygnamagyň ähli döwründe wagtyň funksiýasy hökmünde öýjük populýasiýalarynyň biomassasyny görkezýär. Injirde \ (t = 5 \) sagatda gury massanyň çalt çüýremegi. Käbir öýjükleriň görnüş meýdanyndan çykmagy sebäpli 6b, c. Bu dört hadysanyň ösüş depgini \ (0.77 \ pm 0.1 \) h-1. Bu baha, öýjükleriň kadaly ösýän 3-nji we 4-nji suratlary bilen baglanyşykly ösüş depgininden has ýokarydyr. Sporlardan G. stearotermofiliň ösüş depgininiň ýokarlanmagynyň sebäbi belli däl, ýöne bu ölçegler LA-HTM-iň gyzyklanmasyny görkezýär we öýjük durmuşynyň dinamikasy barada has giňişleýin öwrenmek üçin bir öýjük derejesinde (ýa-da bir mCFU derejesinde) işleýär. .
LA-HTM-iň köpugurlydygyny we ýokary temperaturada öndürijiligini has-da görkezmek üçin, optimal ösüş temperaturasy 80 ° C51 bolan gipertermofil asidofil arhae bolan Sulfolobus şibatanyň ösüşini gözden geçirdik. G. stearothermophilus bilen deňeşdirilende, bu arhaýalarda uzyn çybyklara (bakilli) däl-de, 1 mikron sfera (kokçi) meňzeýän gaty üýtgeşik morfologiýa bar.
7a surat, CGM ulanyp alnan S. shibatae mCFU-nyň yzygiderli optiki çuňluk şekillerinden ybarat (goşmaça materiallarda M7 çeper filmine serediň). Bu mCFU iň amatly temperaturadan 80 ° C-den aşakda, ýöne işjeň ösmek üçin temperatura aralygynda 73 ° C töweregi ösýär. MCFU-lary birnäçe sagatdan soň arhaýanyň mikrograplaryna meňzeýän köp bölek hadysalaryna syn etdik. Bu OT şekillerinden mCFU biomassasy wagtyň geçmegi bilen ölçeldi we 7b suratda görkezildi. Gyzykly tarapy, S. shibatae mCFU-lary G. stearothermophilus mCFU-lary bilen görülýän ekspensial ösüşi däl-de, çyzykly ösüşi görkezdi. Öýjükleriň ösüş depginleriniň tebigaty barada köpden bäri 52 pikir alyşylýar: käbir gözleglerde ululygyna (ekspensial ösüş) proporsional mikroblaryň ösüş depgini habar berilýär, beýlekileri hemişelik tizligi görkezýär (çyzykly ýa-da bilinear ösüş). Tzur we al.53-iň düşündirişi ýaly, ekspensial we (bi) çyzykly ösüşi tapawutlandyrmak, biomassanyň ölçeglerinde <6% takyklygy talap edýär, bu QPM usullarynyň köpüsine ýetip bolmaýar, hatda interferometriýany hem öz içine alýar. Tzur we al.53-iň düşündirişi ýaly, ekspensial we (bi) çyzykly ösüşi tapawutlandyrmak, biomassanyň ölçeglerinde <6% takyklygy talap edýär, bu QPM usullarynyň köpüsine ýetip bolmaýar, hatda interferometriýany hem öz içine alýar. Как объяснили Цур и др.53, различение зононен чинного и (би) сигого роста требует точности <6% в измерениях биомассы, что недостижимо для большинствааов QPM, daже с еппрочовы Zur we al.53 bilen düşündirilişi ýaly, ekspensial we (bi) çyzykly ösüşi tapawutlandyrmak, biomassanyň ölçeglerinde <6% takyklygy talap edýär, bu QPM usullarynyň köpüsine, hatda interferometriýany hem ulanyp bolmaýar.Zur we başganyň düşündirişi ýaly. 53, ekspensial we (bi) çyzykly ösüşi tapawutlandyrmak, biomassanyň ölçeglerinde 6% -den az takyklygy talap edýär, bu interferometriýa ulanylanda-da QPM usullarynyň köpüsine ýetip bolmaýar. CGM bu takyklygy biomassanyň ölçeglerinde sub-pg takyklygy bilen ýetýär36,48.
6 OT şekilinden (ýag çümdürilmegi, 60x, NA maksat 1.25) we (b) CGM bilen ölçenen mikro-CFU biomassanyň ewolýusiýasyndan ybarat wagt aralygy. Has giňişleýin maglumat üçin M7 filmine serediň.
S. şibatanyň ajaýyp çyzykly ösüşi garaşylmadyk ýagdaýda bolupdy we entek habar berilmedi. Şeýle-de bolsa, iň bolmanda ekspensial ösüşe garaşylýar, sebäbi wagtyň geçmegi bilen 2, 4, 8, 16… öýjükleriň köp bölünişi bolmaly. Öýjükleriň ösüşi haýallaýar we öýjükleriň dykyzlygy aşa ýokary bolanda, öýjügiň dykyzlygy sebäpli çyzykly ösüş öýjükleriň saklanmagy sebäpli bolup biler diýip çakladyk.
Öz gezegimizde aşakdaky bäş gyzyklanma nokadyny ara alyp maslahatlaşmak bilen netijä gelýäris: ýyladyş göwrüminiň peselmegi, ýylylyk inersiýasynyň peselmegi, altyn nanobölejiklere bolan gyzyklanma, mukdar fazasynyň mikroskopiýasyna gyzyklanma we LA-HTM ulanyp boljak temperatura diapazony.
Garşylykly ýyladyş bilen deňeşdirilende, HTM ösüşi üçin ulanylýan lazerli ýyladyş birnäçe artykmaçlygy hödürleýär, bu işde görkezýäris. Hususan-da, mikroskop görnüşinde suwuk metbugatda ýyladyş mukdary birnäçe (10 μm) 3 jiltde saklanýar. Şeýlelik bilen, diňe gözegçilik edilýän mikroblar işjeňdir, beýleki bakteriýalar bolsa işlemeýär we nusgany has giňişleýin öwrenmek üçin ulanylyp bilner - her gezek täze temperatura barlanylanda nusgany üýtgetmegiň zerurlygy ýok. Mundan başga-da, mikroskale ýyladyş köp temperaturany gönüden-göni barlamaga mümkinçilik berýär: 4c surat 3 sagatlyk filmden (M3 film) alyndy, bu adatça birnäçe nusganyň taýýarlanylmagyny we gözden geçirilmegini talap edýär - öwrenilýän nusgalaryň her biri üçin. y - synagda günleriň sanyny görkezýän temperatura. Gyzdyrylan sesiň peselmegi mikroskopyň töweregindäki optiki komponentleriň hemmesini, esasanam obýektiw linzany otag temperaturasynda saklaýar, bu jemgyýet şu wagta çenli ýüzbe-ýüz bolýan esasy mesele. LA-HTM islendik linza, şol sanda ýag çümdürmek linzalary bilen ulanylyp bilner we hatda aşa gyzgynlyk bilen hem otag temperaturasynda galar. Bu gözlegde habar berýän lazer bilen ýyladyş usulynyň esasy çäklendirmesi, ýapyşmaýan ýa-da ýüzmeýän öýjükleriň gözýetim meýdanyndan uzak bolmagy we öwrenmek kyn bolmagydyr. Birnäçe ýüz mikrondan ýokary temperaturanyň ýokarlanmagyny gazanmak üçin pes ulaldyjy linzalary ulanmak. Bu seresaplyk giňişlik çözgüdiniň peselmegi bilen utgaşýar, ýöne maksat mikroorganizmleriň hereketini öwrenmek bolsa, ýokary giňişlik çözgüdi talap edilmeýär.
Ulgamy ýylatmak (we sowatmak) üçin wagt ölçegi \ ({{{{{\ rm {\ tau}}}}}}}} _ {{\ mbox {D}}}} \) ululygyna bagly, kanuna laýyklykda \ ({{{{ (L \) ýylylyk çeşmesiniň häsiýetli ululygydyr (gözlegimizde lazer şöhlesiniň diametri \ (L \ takmynan 100 \) μm), \ (D \) daşky gurşawyň ýylylyk ýaýramagydyr (ortaça biziň korpus, aýna we suw Diffuziýa derejesi \ (D \ takmynan 2 \ fold {10} ^ {- 7} \) m2 / s) Şonuň üçin bu gözlegde 50 ms tertibiniň wagt jogaplary, ýagny dessine Temperaturanyň üýtgemegine garaşylýar, temperaturanyň ýokarlanmagynyň dessine döredilmegi synagyň dowamlylygyny gysgaltman, eýsem temperaturanyň täsirini dinamiki öwrenmek üçin takyk wagty (\ t = 0 \) hem berýär.
Teklip edilýän usulymyz, ýagtylygy siňdirýän substrata (mysal üçin, ITO örtükli täjirçilik nusgalaryna) degişlidir. Şeýle-de bolsa, altyn nanobölejikler, görünýän aralykda infragyzyl we pes sorulmagy üpjün edip bilýär, soňky häsiýetleri görünýän diapazonda täsirli optiki synlamak üçin esasanam floresan ulanylanda gyzyklanýar. Mundan başga-da, altyn biokompatif, himiki taýdan inert, optiki dykyzlygy 530 nm-den infragyzyllyga ýakynlaşdyrylyp bilner we nusga taýýarlamak ýönekeý we tygşytly29.
Transvers panjara tolkunly mikroskopiýa (CGM) diňe bir mikroskalda temperatura kartasyny düzmäge mümkinçilik bermän, eýsem LA-HTM bilen bilelikde aýratyn peýdaly (zerur bolmasa) biomassanyň gözegçiligini hem üpjün edýär. Soňky on ýylda beýleki bio-şekillendiriş pudagynda beýleki temperatura mikroskopiýa usullary işlenip düzüldi we köpüsi temperatura duýgur floresan zondlaryň ulanylmagyny talap edýär54,55. Şeýle-de bolsa, bu usullar tankyt edildi we käbir hasabatlar öýjükleriň içindäki hakyky bolmadyk temperatura üýtgemelerini ölçedi, belki floresan temperaturadan başga köp faktorlara baglydyr. Mundan başga-da, floresan zondlaryň köpüsi ýokary temperaturada durnuksyz. Şonuň üçin QPM we esasanam CGM optiki mikroskopiýa ulanyp, ýokary temperaturada durmuşy öwrenmek üçin ideal temperatura mikroskopiýa usulyny görkezýär.
80 ° C-de optimal ýaşaýan S. şibatanyň gözlegleri, LA-HTM-iň diňe ýönekeý termofilleri däl-de, gipertermofilleri öwrenmek üçin ulanylyp bilinjekdigini görkezýär. Aslynda, LA-HTM ulanyp boljak temperatura diapazonynyň çägi ýok, hatda 100 ° C-den ýokary temperatura hem gaýnadylman atmosfera basyşyna ýetip bolýar, 38 toparymyzyň atmosferadaky gidrotermiki himiýa programmalarynda görkezişi ýaly. basyş A. Altyn nanobölejikleri 40-da gyzdyrmak üçin lazer ulanylýar. Şeýlelik bilen, LA-HTM adaty şertlerde (ýagny daşky gurşaw stresinde) adaty ýokary çözgütli optiki mikroskopiýa bilen görlüp-eşidilmedik gipertermofilleri synlamak üçin ulanylýar.
Synaglaryň hemmesi, öýde öndürilen mikroskop, şol sanda Köhler yşyklandyrylyşy (LED, M625L3, Thorlabs, 700 mWt), el bilen hereket etmek, maksatlar (Olympus, 60x, 0.7 NA, howa, LUCPlanFLN60X ýa-da 60x, 1.25 NA, Nebit) bilen geçirildi. , UPLFLN60XOI), intensiwligi we tolkun şekillendirişini üpjün etmek üçin CGM kamerasy (QLSI kesiş paneli, 39 µm meýdança, Andor Zyla kamera datçisinden 0,87 mm) we sCMOS kamerasy (ORAM Flash 4.0 V3, 16 bitli re modeim, Hamamatsudan) 5-nji suratda görkezilen maglumatlar (bakterial ýüzmek). Ikitaraplaýyn şöhle bölüji 749 nm BrightLine gyrasydyr (Semrock, FF749-SDi01). Kameranyň öňündäki süzgüç 694 gysga geçiş süzgüçidir (FF02-694 / SP-25, Semrock). Titan sapfir lazeri (Lazer Verdi G10, 532 nm, 10 W, nasosly sunami lazer boşlugy, 2-5-nji suratda spektra-fizika, mundan başga-da Millenia lazeri, Spektrafizika 10 W, Mira lazer boşlugy, Coherent, 2-nji surat üçin nasos. -5). 6 we 7) tolkun uzynlygyna \ { 1152 piksel) “Meadowlark Optics” -den satyn alyndy.
Haçly örtük tolkun mikroskopiýasy (CGM), adaty kameranyň datçisinden bir millimetr uzaklykda iki ölçegli difraksiýa örtügini (haç örtügi diýlip hem atlandyrylýar) birleşdirmäge esaslanýan optiki mikroskopiýa usulydyr. Bu gözlegde ulanan CGM-iň iň köp ýaýran mysaly, dört tolkun uzynlygy transvers smena interferometri (QLSI) diýilýär, bu ýerde kesişme Primot we başgalar tarapyndan girizilen we patentlenen intensiwlik / faza barlag tagtasynyň nagşyndan durýar. Dik we gorizontal gözenek çyzyklary datçigiň gözenegine meňzeş kölegeleri döredýär, ýoýulmasy wakanyň çyrasynyň optiki tolkun meýdançasynyň ýoýulmagyny (ýa-da şoňa meňzeş faza profilini) almak üçin hakyky wagtda san taýdan işlenip bilner. CGM kamerasy mikroskopda ulanylanda, nanometrleriň tertibi boýunça duýgurlyk bilen optiki çuňluk (OT) diýlip atlandyrylýan şekillendirilen obýektiň optiki ýol tapawudyny görkezip biler36. Islendik CGM ölçeginde, optiki komponentlerde ýa-da şöhlelerde ýüze çykýan kemçilikleri aradan aýyrmak üçin esasy salgylanma OT şekili alynmaly we indiki suratlardan aýrylmaly.
Temperatura mikroskopiýasy, salgylanmada görkezilişi ýaly CGM kamerasy arkaly geçirildi. Gysgaça aýdylanda, suwuklygy gyzdyrmak, refraktiw görkezijini üýtgedýär we hadysanyň şöhlesini ýoýýan termiki linza täsirini döredýär. Bu tolkun meýdançasynyň ýoýulmagy CGM bilen ölçelýär we suwuk gurşawda üç ölçegli temperatura paýlanyşyny almak üçin dekonwolýusiýa algoritmi bilen işlenýär. Altyn nanobölejikler nusganyň hemme ýerinde deň paýlanan bolsa, has gowy şekilleri öndürmek üçin bakteriýalarsyz ýerlerde temperatura kartasy edilip bilner, bu bolsa käwagt edýäris. CGM şekili ýyladyşsyz (lazer öçürilen) alyndy we soňra lazer bilen suratdaky şol bir ýerde düşürildi.
Gury köpçülik ölçegi, temperaturany surata almak üçin ulanylýan şol bir CGM kamerasy arkaly gazanylýar. CGM salgylanma şekilleri, bakteriýalaryň bolmagy sebäpli OT-de islendik birmeňzeşligi ortaça kesgitlemegiň serişdesi hökmünde ekspozisiýa wagtynda nusgany x we y-da çalt herekete getirmek arkaly alyndy. Bakteriýalaryň OT şekillerinden, olaryň biomassasy, Matlabyň öýde ýasalan segmentasiýa algoritmini (“San kody” bölümine serediň) ulanyp, saýlanan ýerlerde suratlaryň ansambly arkaly alyndy. Gysgaça aýdanymyzda, gatnaşygy ulanýarys \ (m = {\ alfa} ^ {- 1} \ iint {{\ mbox {OT}}} \ çep (x, y \ sag) {{\ mbox {d}} } x {{\ mbox {d}}} y \), bu ýerde \ ({{\ mbox {OT}}} \ çep (x, y \ sag) \) optiki çuňluk şekili, \ (m \) gury agram we \ ({{{{{\ rm {\ alfa}}}}}} \) hemişelikdir. Janly öýjükler üçin adaty hemişelik bolan \ ({{{{\ rm {\ alfa))))) = 0.18 \) µm3 / pg saýladyk.
Diametri 25 mm we altyn nanobölejikler bilen örtülen galyňlygy 150 µm bolan örtük süýşmesi, altyn nanobölejikler bilen AttofluorTM kamerasyna (Termofişer) ýerleşdirildi. Geobacillus stearothermophilus, synaglaryň her gününden öň LB ortaça (200 aýlaw, 60 ° C) bir gijede ösdürilip ýetişdirildi. Altyn nanobölejikler bilen örtülen çyzgyda optiki dykyzlygy (OD) 0,3 - 0,5 bolan G. stearothermofilusyň 5 µl damjasy goýuldy. Soňra, diametri 18 mm bolan diametri 18 mm bolan tegelek örtük süýşmesi aşak gaçdy we deşikiň merkezine şol bir optiki dykyzlygy bolan 5 μl bakterial asma ulanyldy. Örtükdäki guýular refde görkezilen tertibe laýyklykda taýýarlandy. 45 (has giňişleýin maglumat üçin goşmaça maglumatlara serediň). Soňra suwuk gatlagyň guramagynyň öňüni almak üçin gapagyň içine 1 ml LB serişdesi goşuň. Iň soňky gapak, inkubasiýa wagtynda gurşawyň bugarmagynyň öňüni almak üçin Attofluor ™ kamerasynyň ýapyk gapagynyň üstünde goýulýar. Ösümlik synaglary üçin adaty synaglardan soň käwagt ýokarky örtügi ýapýan sporlary ulanýardyk. Sulfolobus şibatasyny almak üçin şuňa meňzeş usul ulanyldy. Üç günlük (200 aýlaw, 75 ° C) Tiobacillus serratasyny deslapky ösdürip ýetişdirmek 182-nji ýylda (DSMZ) geçirildi.
Altyn nanobölejikleriň nusgalary mikellar blok kopolimer litografiýasy tarapyndan taýýarlandy. Bu amal bapda jikme-jik beýan edilýär. Gysgaça, altyn ionlaryny gurşap alýan mikeller, kopolimeri HAuCl4 bilen toluene garyşdyrmak arkaly sintez edildi. Arassalanan örtükler soňra ergine çümdürildi we altyn tohumyny almak üçin azaldýan serişdäniň barlygynda UV şöhlelenmesi bilen bejerildi. Ahyrynda, altyn tohumlary KAuCl4 we etanolaminiň suwly ergini bilen örtülen ýapgy bilen 16 minutlap ösdürilip ýetişdirildi, netijede ýakyn infragyzyllykda sferik däl altyn nanobölejikleriň kwaza-döwürleýin we birmeňzeş tertibi emele geldi.
Interferogrammalary OT şekillerine öwürmek üçin, baglanyşykda jikme-jik görkezilişi ýaly, öýde ýasalan algoritmi ulandyk. 33 we aşakdaky köpçülikleýin ammarda Matlab bukjasy hökmünde elýeterlidir: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paket, ýazylan interferogrammalara (salgylanma suratlaryny goşmak bilen) we kamera massiw aralyklaryna esaslanyp intensiwligi we OT şekillerini hasaplap biler.
Berlen temperatura profilini almak üçin SLM-de ulanylýan faza nagşyny hasaplamak üçin, ozal döredilen öýde öndürilen algoritm 39,42 ulandyk, aşakdaky jemgyýetçilik ammarynda bar: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Giriş, sanly ýa-da monohrom bmp şekili arkaly kesgitlenip bilinýän islenýän temperatura meýdanydyr.
Öýjükleri bölmek we gury agramyny ölçemek üçin aşakdaky köpçülikleýin ammarda çap edilen Matlab algoritmimizi ulandyk: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Ulanyjy her bir suratda bakteriýalara ýa-da gyzyklanýan mCFU-a basmaly, taýagyň duýgurlygyny sazlamaly we saýlamany tassyklamaly.
Okuw dizaýny barada has giňişleýin maglumat üçin bu makala bilen baglanyşykly Tebigat gözleg hasabatyna serediň.
Bu gözlegiň netijelerini goldaýan maglumatlar, degişli awtorlardan degişli isleg boýunça elýeterlidir.
Bu gözlegde ulanylýan deslapky kody Usullar bölüminde jikme-jik görkezilýär we düzediş wersiýalaryny https://github.com/baffou/ aşakdaky ammarlarda göçürip alyp bilersiňiz: SLM_temperatureShaping, CGMprocess we CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Termofillere düşünmek we olaryň giň spektrli goşundylary. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Termofillere düşünmek we olaryň giň spektrli goşundylary.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. we Sharma, AK Termofillere syn we olaryň giň ulanylyşy. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. we Sharma AK Termofillere çuňňur düşünmek we amaly goşundylar.3 Biotehnologiýa 6, 81 (2016).
Iş wagty: 26-2022-nji sentýabr